蛋白質(zhì)的修飾和表達-wenkub.com
2025-01-09 07:36 本頁面
【正文】 目前采州的哺乳動物細胞表達戟體大都帶有來自 pBR322的衍生質(zhì)粒如 pX[ pBRd和pM[的原核序列； ? ②啟動子和增強子； ? ③剪接信號； ? ④終止信號和 poIyA加尾信號 ? 遺傳選擇標記 ：胸腺激酶 (tk)基因、二氫葉酸還原酶 (dh]r)基因、新霉素 (neo)抗性基因、氯霉素乙?；D(zhuǎn)移酶 (cat)基因等 dhfr還可作為共擴增基因使外源基因的表達產(chǎn)物增加 宿主細胞 ? 常用的非淋巴細胞類有中國倉鼠卵巢 (CHO)細胞、小倉鼠腎 (BHK)細胞、 COS細胞、小鼠 NSO胸腺瘤細胞和小鼠骨髓瘤 SP2/0細胞等 ? CHO細胞則利于外源基因的穩(wěn)定整合，易于大規(guī)模培養(yǎng)，能在無血清和蛋白的條件下生產(chǎn)，是用于真核生物基因表達軟為成功的宿主細胞。 ? 質(zhì)粒載體則是借助于物理或化學的作用導人細胞內(nèi)。在酵母細胞中可以產(chǎn)生 N和 O連接的糖基化，從而糖組分與蛋白質(zhì)分子共價相連。 ? 優(yōu)點：遺傳學和生理學背景清楚；容易培養(yǎng)，高密度發(fā)酵； ? 缺點： ①沒有真核轉(zhuǎn)錄后加工的功能 ? ②沒有真核翻譯后加工的功能 ? ③表達的蛋白質(zhì)經(jīng)常是不溶的，會在細菌內(nèi)聚集成包涵體 ? 如何改善外源蛋白的溶解性？ ? 外源蛋白的分泌表達 ? 細菌生長溫度：改善在細胞質(zhì)中表達蛋白溶解性的最簡單方法是在誘導過程中降低工程菌的生長溫度（降低到 30度或更低）；通過用較弱的啟動子減慢蛋白合成速率或利用部分誘導條件也可防止蛋白的錯折疊和聚集，而使大量可溶蛋白積累。 ? 兩者的不同： ?進化動力不同： 保守突變 非保守取代； ?進化方向不同： 適應突變的積累； ?進化速度不同： 非常漫長 只需幾年、甚至幾天； ? 進化目標不同： 適應環(huán)境 超越生物學意義的要 求，探索所希望的蛋白質(zhì)在順序空間的可及性。 體外隨機引發(fā)重組 體外隨機引發(fā)重組(random priming in vitro rebination, RPR)以單鏈 DNA為模板，配合一套隨機序列引物，先產(chǎn)生大量互補于模板不同位點的短 DNA片段，由于堿基的錯配和錯誤引發(fā)，這些短DNA片段中也會有少量的點突變，在隨后的PCR反應中，它們 互為引物 進行合成，伴隨組合，再組裝成完整的基因長度 交錯延伸 交錯延伸 (stagger extension process, StEP) 在 PCR反應中把常規(guī)的 退火和延伸合并為一步 , 縮短其反應時間，從而只能合成出非常短的新生鏈，經(jīng)變性的新生鏈再作為引物與體系內(nèi)同時存在的不同模板退火而繼續(xù)延伸。 將異源雙鏈 DNA分子轉(zhuǎn)化大腸桿菌后 ,產(chǎn)生野生型、突變型的同源雙鏈 DNA分子。這一現(xiàn)象可用來產(chǎn)生半合成的類似物 ? 產(chǎn)生二硫鍵 二硫鍵被還原劑打開，多肽彼此分開 DTT、 二硫蘇糖醇 將這些片斷與適當?shù)谋恍揎椀幕蚝铣傻牧硪浑南嗷旌希ㄟ^重新形成二硫鍵而形成嵌合分子 ? 形成肽鍵 通過酶連接反應形成肽鍵 從豬胰島素生產(chǎn)人胰島素 將 B鏈丙氨酸殘基改為蘇氨酸殘基（胰蛋白酶） 通過酶法與活性酯偶聯(lián) 羥基琥珀酰亞胺酯作為接頭分子 ? 產(chǎn)生非天然型共價鍵 利用雙功能試劑可以將不同的蛋白質(zhì)連在一起。 化學修飾影響的條件 ? 溫和的反應條件是防止蛋白質(zhì)分子變性的一個必要條件 ? pH值得變化：決定了具有潛在反應能力的基團所處的可反應和不可反應的離子狀態(tài)。 ? 判斷蛋白質(zhì)分子中有無二硫鍵，是鏈內(nèi)二硫鍵還是鏈間二硫鍵的方法可用非還原 /還原雙向 SDSPAGE電泳技術。完全亞氨代乙?；牡鞍踪|(zhì)仍保持在水溶液中的可溶性。 二、蛋白質(zhì)功能的全新設計
教學課件相關推薦
鄂ICP備17016276號-1