蛋白質(zhì)的修飾和表達(dá)(編輯修改稿)
2025-02-08 07:36 本頁(yè)面
【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 率高 缺點(diǎn)：合成多條引物的成本較高 蛋白質(zhì)定向進(jìn)化 ? 1993年，美國(guó)科學(xué)家 Arnold Fh 首先提出酶分子的定向進(jìn)化的概念 易錯(cuò) PCR技術(shù)為代表的無(wú)性進(jìn)化 DNA shuffling為代表的有性進(jìn)化 定向進(jìn)化技術(shù) ? 人為地創(chuàng)造特殊的進(jìn)化條件，模擬自然進(jìn)化機(jī)制，在體外對(duì)基因進(jìn)行 隨機(jī)突變 ，從一個(gè)或多個(gè)已經(jīng)存在的親本蛋白質(zhì)（天然的或者人為獲得的）出發(fā)，經(jīng)過(guò)基因的突變和重組，構(gòu)建一個(gè)人工突變酶庫(kù)，通過(guò)一定的 篩選或選擇 方法最終獲得預(yù)先期望的 具有某些特性的進(jìn)化蛋白質(zhì) 定向進(jìn)化的原理 ? 易錯(cuò) PCR技術(shù) (errorprone PCR) ? DNA改組 (DNA shuflling)：由美國(guó) Stemmer 于 1994 年首次提出 一項(xiàng)體外重組技術(shù) ? 隨機(jī)引發(fā)重組 (RPR) 1998 年 , Arnold 提出了一種有效的新方法 ? 交錯(cuò)延伸技術(shù) (StEP)：由 Zhao 等 提出 , 是一種簡(jiǎn)化的 DNA shuffling 技術(shù) 隨機(jī)突變的策略 ? 易錯(cuò) PCR（ error prone PCR）是指在擴(kuò)增目的基因的同時(shí)引入堿基錯(cuò)配，導(dǎo)致目的基因隨機(jī)突變 ? 連續(xù)易錯(cuò) PCR (sequential error prone PCR)策略。即將一次 PCR擴(kuò)增得到的有用突變基因作為下一次 PCR擴(kuò)增的模板，連續(xù)反復(fù)地進(jìn)行隨機(jī)誘變 易錯(cuò) PCR DNA改組和外顯子改組 ? DNA改組 (DNA shuffling)又稱有性PCR (sexual PCR)，原理如圖所示 ? 外顯子改組 (exon shuffling類似于 DNA改組，與但與其不同，它是靠同一種分子間 內(nèi)含子的同源性帶動(dòng) ，而DNA改組不受任何限制，發(fā)生在整個(gè)基因片段上。 體外隨機(jī)引發(fā)重組 體外隨機(jī)引發(fā)重組(random priming in vitro rebination, RPR)以單鏈 DNA為模板，配合一套隨機(jī)序列引物，先產(chǎn)生大量互補(bǔ)于模板不同位點(diǎn)的短 DNA片段，由于堿基的錯(cuò)配和錯(cuò)誤引發(fā)，這些短DNA片段中也會(huì)有少量的點(diǎn)突變，在隨后的PCR反應(yīng)中，它們 互為引物 進(jìn)行合成，伴隨組合，再組裝成完整的基因長(zhǎng)度 交錯(cuò)延伸 交錯(cuò)延伸 (stagger extension process, StEP) 在 PCR反應(yīng)中把常規(guī)的 退火和延伸合并為一步 , 縮短其反應(yīng)時(shí)間，從而只能合成出非常短的新生鏈，經(jīng)變性的新生鏈再作為引物與體系內(nèi)同時(shí)存在的不同模板退火而繼續(xù)延伸。此過(guò)程反復(fù)進(jìn)行，直到產(chǎn)生完整的基因長(zhǎng)度 定向進(jìn)化的篩選策略 突變體分離 ? 瓊脂板涂布法 在特殊條件下培養(yǎng)突變菌，通過(guò)宿主菌的生長(zhǎng)情況、培養(yǎng)基顏色、特定反應(yīng)的出現(xiàn)等判斷是否具有目的基因 ? 微孔板懸浮法 在含生色底物平板上培養(yǎng)，挑取具有活性的克隆接種到 96孔板上檢測(cè)吸光度。使用微流控芯片 ? 微球細(xì)胞固定法 與數(shù)字成像系統(tǒng)結(jié)合，將單個(gè)細(xì)胞附著在單個(gè)固體珠上，突變體進(jìn)行分離和篩選 ? 流式細(xì)胞計(jì)數(shù)法 細(xì)胞經(jīng)熒光染色后，通過(guò)高速流動(dòng)系統(tǒng)，排成單行，逐個(gè)通過(guò)流式細(xì)胞計(jì)數(shù)儀進(jìn)行測(cè)定 ? 通過(guò)酶促反應(yīng)的特征 ? 加入底物顯色 ? 熒光共振能量轉(zhuǎn)移 ? 同位素標(biāo)記底物 ? 通過(guò)檢測(cè)底物消耗或產(chǎn)物生成進(jìn)行終點(diǎn)檢測(cè) 酶檢測(cè) 信號(hào)探測(cè) ? 分光光度計(jì)和熒光酶標(biāo)儀 ? 氣相色譜和高效液相色譜 ? 質(zhì)譜和核磁 定向進(jìn)化與自然進(jìn)化的異同點(diǎn) ? 定向進(jìn)化的實(shí)質(zhì)是達(dá)爾文進(jìn)化論在分子水平上的延伸和應(yīng)用。 ? 定向進(jìn)化是在體外模擬突變、重組和選擇的自然進(jìn)化，使進(jìn)化朝著人們需要的方向發(fā)展。 ? 兩者的不同： ?進(jìn)化動(dòng)力不同： 保守突變 非保守取代； ?進(jìn)化方向不同： 適應(yīng)
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