蛋白質(zhì)的修飾和表達(dá)-資料下載頁(yè)
2025-01-12 07:36本頁(yè)面
【正文】 ，產(chǎn)生在特定位點(diǎn)突變成UAG的 mRNA， ? 通過體外反以體系，將非天然氨基酸摻入到蛋白質(zhì)分子中的特定位點(diǎn) 外源蛋白表達(dá)體系 ? 原核表達(dá)體系：大腸桿菌 ? 真核表達(dá)體系：酵母、昆蟲、哺乳動(dòng)物 原核表達(dá)體系 ? 是外源基因表達(dá)的首選體系，只有在大腸桿菌中的表達(dá)產(chǎn)物由于不能正確折疊或缺少翻譯后修飾而沒有生物活性，或當(dāng)天然蛋白質(zhì)的回收率太低時(shí)，才考慮選擇其它表達(dá)體系。 ? 優(yōu)點(diǎn)：遺傳學(xué)和生理學(xué)背景清楚；容易培養(yǎng)，高密度發(fā)酵； ? 缺點(diǎn)： ①?zèng)]有真核轉(zhuǎn)錄后加工的功能 ? ②沒有真核翻譯后加工的功能 ? ③表達(dá)的蛋白質(zhì)經(jīng)常是不溶的，會(huì)在細(xì)菌內(nèi)聚集成包涵體 ? 如何改善外源蛋白的溶解性？ ? 外源蛋白的分泌表達(dá) ? 細(xì)菌生長(zhǎng)溫度：改善在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)蛋白溶解性的最簡(jiǎn)單方法是在誘導(dǎo)過程中降低工程菌的生長(zhǎng)溫度（降低到 30度或更低）；通過用較弱的啟動(dòng)子減慢蛋白合成速率或利用部分誘導(dǎo)條件也可防止蛋白的錯(cuò)折疊和聚集，而使大量可溶蛋白積累。 ? 外源蛋白與分子伴侶和折疊酶共表達(dá) ? 外源蛋白與相關(guān)蛋白或蛋白標(biāo)簽融合：如與硫氧環(huán)蛋白、His6標(biāo)簽等功表達(dá)可以增加外源蛋白的溶解性。 酵母表達(dá)體系 ? 表達(dá)載體： Yep（酵母附加體質(zhì)粒）和 YCp（酵母著絲點(diǎn)質(zhì)粒），二者都含有促進(jìn)在酵母中自主復(fù)制的序列，或 ARS序列元件。是多拷貝質(zhì)粒 ? 甲醇酵母系統(tǒng) ? 外源蛋白質(zhì)在酵母細(xì)胞中可以在蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶的作用下形成正確的二硫鍵。在酵母細(xì)胞中可以產(chǎn)生 N和 O連接的糖基化，從而糖組分與蛋白質(zhì)分子共價(jià)相連。 ? 哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)勢(shì)在于能夠指導(dǎo)蛋白質(zhì)的正確折疊，提供復(fù)雜的 N型糖基化和準(zhǔn)確的 O型糖基化等多種翻譯后加工功能，因而表達(dá)產(chǎn)物在分子結(jié)構(gòu)、理化特性和生物學(xué)功能方面最接近于天然的高等生物蛋白質(zhì)分子。 ? 哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)外源重組蛋白可利用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染和病毒載體的感染 ? 病毒載體是以病毒顆粒的方式，通過病毒包膜蛋白與宿主細(xì)胞膜的相互作用使外源基因進(jìn)入到細(xì)胞內(nèi)。常用的病毒載體有腺病毒、腺相關(guān)病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、 semliki森林病毒 (sFv)載體等。 ? 質(zhì)粒載體則是借助于物理或化學(xué)的作用導(dǎo)人細(xì)胞內(nèi)。依據(jù)質(zhì)粒在宿主細(xì)胞內(nèi)是否具有自我復(fù)制能力，可將質(zhì)粒載體分為整合型和附加體型載體兩類。整合型載體無復(fù)制能力，需整合于宿主細(xì)胞染色體內(nèi)方能穩(wěn)定存在而附加體型載體則是在細(xì)胞內(nèi)以染色體外可自我復(fù)制的附加體形式存在。整合型載體一般是隨機(jī)整合入染色體，其外源基因的表達(dá)受插入位點(diǎn)的影響，同時(shí)還可能會(huì)改變宿主細(xì)胞的生長(zhǎng)特性 表達(dá)載體的表達(dá) ? ① 原核 DNA序列，包括能在大腸桿菌中自身復(fù)制的復(fù)制子，便于篩選含螢組細(xì)菌的抗生素抗性基躅，以及便于目的基因插入的限制性酶切位點(diǎn)。目前采州的哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)戟體大都帶有來自 pBR322的衍生質(zhì)粒如 pX[ pBRd和pM[的原核序列； ? ②啟動(dòng)子和增強(qiáng)子； ? ③剪接信號(hào)； ? ④終止信號(hào)和 poIyA加尾信號(hào) ? 遺傳選擇標(biāo)記 ：胸腺激酶 (tk)基因、二氫葉酸還原酶 (dh]r)基因、新霉素 (neo)抗性基因、氯霉素乙?；D(zhuǎn)移酶 (cat)基因等 dhfr還可作為共擴(kuò)增基因使外源基因的表達(dá)產(chǎn)物增加 宿主細(xì)胞 ? 常用的非淋巴細(xì)胞類有中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢 (CHO)細(xì)胞、小倉(cāng)鼠腎 (BHK)細(xì)胞、 COS細(xì)胞、小鼠 NSO胸腺瘤細(xì)胞和小鼠骨髓瘤 SP2/0細(xì)胞等 ? CHO細(xì)胞則利于外源基因的穩(wěn)定整合，易于大規(guī)模培養(yǎng)，能在無血清和蛋白的條件下生產(chǎn)，是用于真核生物基因表達(dá)軟為成功的宿主細(xì)胞。已用于多種復(fù)雜的重組蛋白的生產(chǎn)，但其產(chǎn)量較低，一般僅占細(xì)胞蛋白的 % ? 降低外源多肽降解的策略 ? 用蛋白酶缺失的菌株作為受體菌；形成融合體；改變生長(zhǎng)條件：饑餓時(shí)可引起蛋白質(zhì)周轉(zhuǎn)率提高，低溫降低蛋白水解，酸性條件抑制外泌蛋白降解（ ）。
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