【正文】 據(jù)庫搜索目標蛋白質 Shotgun策略 酶解得到肽混合物 多維色譜分離 MS/MS質譜鑒定 , 序列分析 MS分析 m/z 譜 比較分析 蛋白質功能分析 (western blot、 免疫組織化學、激光共聚焦顯微技術、分子生物學技術 ) Topdown versus bottomup proteomics ? Topdown ? Advantages ? Complete protein sequence access ? PTM location ? No protein digestion required ? Disadvantages ? MS equipments are expensive to purchase and operate ? Does not work well for large proteins (50kDa) ? Limitation in coupling with online separations ? Protein fragmentation poorly understood ? Bottomup ? Advantages ? More mature technique ? Can be fully automated ? Feasible for plicated samples ? Quantification ? Disadvantages ? Partial sequence coverage ? Loss of information of PTMs ? Loss of information about lowabundance proteins 蛋白質組學通常分為 4種研究模式 ? 完全蛋白質組學，是檢測特定細胞或組織內(nèi)所有蛋白質組成、定位、理化參數(shù)等； ? 功能蛋白質學，研究與某一功能相關的所有蛋白質； ? 修飾蛋白質組學，研究蛋白質修飾，如甲基化、磷酸化、泛素化等； ? 比較蛋白質組學（差異蛋白質組學），通過比較分析不同狀態(tài)下細胞或組織蛋白質表達圖譜，著重研究不同生物體在不同時刻或狀態(tài)下蛋白質表達的變化情況，發(fā)現(xiàn)與特定生理病理狀態(tài)密切相關的差異表達蛋白，從而闡明特定生理病理狀態(tài)產(chǎn)生的本質規(guī)律。 Pandey A , Mann M. Proteomics to study genes and genomes. Nature ,2022 ,405(6788) :837 846. 比較蛋白質組學 ? 比較蛋白質組學（ Comparative Proteomics）針對不同空間、不同時間上動態(tài)變化著的蛋白質組的整體進行比較，分析不同蛋白質組之間在表達數(shù)量、表達水平和修飾狀態(tài)上的差異，可以發(fā)現(xiàn)與病變相關的特異蛋白質。 ? Comparative Proteomics： Study the proteomic changes in different states by identifying differentially expressed proteins and their modification Comparative Proteomics Purposes： Therapeutic target discovery Diagnostic/prognostic marker development Mechanistic study 空間上的差異 時間上的差異 N D N D N D 0 1000 15 89 1056.1 1326.7 1923.4 2100.6 600 2200 62 76 99 1501.9 1759.8 attttaaaatattcctatttaaaaaaaatgaaatta M K L gatccatcaaaatgtgttcaagtttcaatctctggt ttaaaacaaataaatactcagcttacttgtaatggt gaaccttgtaatactccaacagttacaccaacaaca ccaactggaccattaaaatttaattataaattagat aatgtacactattatcaatatagagttacagtaaca R V A D D Q F R V E D F S I N F Y Y A L A L K S Y D E P C N T P T V T P T T P T G P L K F N Y K L D 比較蛋白質組學的研究模式 starting tissue sample points 2DE map differentially expressed spots peptide MS and MSMS protein sequence metabolic drug targets N D Mass spectrometry 比較蛋白質組學研究具有的優(yōu)勢： ? 在技術上有更高的可實現(xiàn)性，目前的研究技術還難以把細胞內(nèi)所有的蛋白質展現(xiàn)出來； ? 可以反映蛋白質的動態(tài)本質； ? 具有廣泛和明確的應用前景，如疾病生物標記物的研究等。 目前蛋白質組研究中的主流技術 Proteome Separation ? 1 DE ? 2 DE ? Multidimensional HPLC Bio – mass Spectrometry ? MALDI TOF MS ? ESI MS ? Hybrid MS/MS Bioinformatics ? Databases ? Tools and Softwares 二維電泳圖譜所傳達的信息 ? 蛋白質的分布范圍 (偏酸性或偏堿性 ) ? 表達蛋白質的可能個數(shù)(凝膠點的數(shù)目 ) ? 蛋白質的的大概相對分子量 ? 蛋白質的的大概相對等電點 ? 蛋白質相對表達豐度(點的灰度值 ) ? 但是，通過二維電泳分離不能得到完整的功能蛋白質，得到的是構成蛋白質的各個亞基。 pI ～ 200 kDa 人血漿中低豐度蛋白質組的 二維電泳圖譜 Standard Method for Complex Peptide Mixture Analysis Cation Exchange RPHPLC ESIMS/MS 質譜分析法 (mass spectrometry, MS) ? 是將化合物形成離子和碎片離子，按質荷比（ m/z）的不同進行分離，來進行成分和結構分析的方法。 ? 質譜分析中，多種離子化技術均可使物質分子失去外層價電子形成分子離子（ molecular ion， M+），分子離子中的化學鍵還可以繼續(xù)發(fā)生某些有規(guī)律的斷裂而形成不同質量的碎片離子（ fragment ion）： M →→→ M + + 碎片離子 + 中性分子 質譜儀的構成 質量分析器 檢測器 計算機 控制與 數(shù)據(jù)處理 樣品導入系統(tǒng) 離子源 真空泵 I m/z 質譜圖 Mass spectrum Inlet System Ion sources Mass analyzers Detector Data system Vacuum Pumping system GCtrap 僅適用于揮發(fā)性物質的分析 MALDITOF MS + PSD 測定分子質量 , 提供某些結構信息 Ion Trap MS 測定分子質量 , 提供詳細的結構信息 Triple quadrupole LC/MS 定量分析 從復雜系統(tǒng)中 提取質量 2Sector FTICR 從復雜系統(tǒng)中提取質量 提供詳細的結構信息 高 低 信息量（Information） 100K 200K 300K 400K 500K 600K 儀器價格（ US￥） LC MS IT TOF LTQ Orbitrap Q TOF TOFTOF 生物信息學 (Bioinformatics) ? 在生命科學的研究中，以計算機為工具對生物信息進行存儲、檢索和分析的一門交叉學科。通過對生物學實驗數(shù)據(jù)的獲取、加工、存儲、檢索與分析，進而揭示數(shù)據(jù)所蘊含的生物學意義。 ? 生物信息學主要研究兩種信息載體 (DNA分子 ,蛋白質分子 ) ? 研究內(nèi)容： ? 基因組生物信息學 ? 蛋白質組生物信息學 ? 代謝調(diào)控生物信息學 Computational approaches to answer biological questions 生物信息學的基本架構 染色體 基因組圖譜 基因組數(shù)據(jù)庫 核酸 DNA序列 核酸序列數(shù)據(jù)庫 蛋白質序列 蛋白質序列數(shù)據(jù)庫 蛋白質結構 蛋白質結構數(shù)據(jù)庫 蛋白質 基因組作圖 序列測定 結構測定 生物信息學 數(shù)據(jù)庫工具 生物信息學 數(shù)據(jù)庫工具 二次數(shù)據(jù)庫；復合數(shù)據(jù)庫 ? 自 1993年起， Nucleic Acids Research 每年都會在第一期推出生物數(shù)據(jù)庫特刊，介紹上一年度的數(shù)據(jù)庫增加和更新情況。 全球蛋白資源數(shù)據(jù)庫 UniProt ? UniProt是目前為止收錄蛋白質序列目錄最廣泛、功能注釋最全面的一個數(shù)據(jù)庫。 ? UniProt由歐洲生物信息學研究所（ European Bioinformatics Institute）、美國蛋白質信息資源（ Prontein Information Resource）以及瑞士生物信息研究所（ Swiss Institute of Bioinformatics）等機構共同組成的 UniProt協(xié)會（ UniProt Consortium）管理。 ? UniProt向所有使用者免費開放，全球科研人員都可以登陸網(wǎng)站 。 專家評說蛋白質組學 ? 2022年 10月 25日，在北京開幕的第三屆國際人類蛋白質組大會上，時任 HUPO主席、加拿大 McGill大學解剖與細胞生物學系主任 John Bergeron教授說，人類基因組圖譜完成后，科學家意識到，絕大部分基因及功能還需要從蛋白質水平予以詮釋和解讀。因為基因組只能決定生命體的基本形式，蛋白質組才能決定生命體的多樣性、復雜性及其功能。 ? 開展蛋白質組研究工作，是科學界延續(xù)了數(shù)十年的一個夢想，因為人類的大多數(shù)疾病是由于蛋白質異常造成的。 ? 當二維電泳、新型質譜技術及各種先進的生物信息和網(wǎng)絡技術為科學家掌握蛋白質表達規(guī)律提供了有力支撐，并且在人類基因組研究實現(xiàn)劃時代飛躍的時候，蛋白質組學便被推上前臺。 專家評說蛋白質組學 ? 而前任 HUPO主席 Samir Hanash教授說：“如果說人類基因組計劃是把人類送入太空，蛋白質組計劃則是促使人類返回地球?！? “現(xiàn)在，我們已經(jīng)把一個人送進宇宙飛船，飛船還在太空中飛了一圈，但至于它什么時候著陸，我們不知道，還需要我們付出巨大的努力?！? HUPO現(xiàn)任主席 ? Rolf Apweiler – President amp。 Chairman of the Board（ ） . ? Rolf Apweiler 是 EMBL的資深專家（ Senior Scientist）和歐洲生物信息學數(shù)據(jù)庫（ EBI?s Sequence Database group）的負責人。由此可以看出，在蛋白質組學的未來發(fā)展中，HUPO對于生物信息學的重視。 總結：對于蛋白質組學的認識 ? 一種新的學術思想 ：以系統(tǒng)生物學的思想對蛋白質組進行研究，詮釋 生命體的多樣性、復雜性及其功能。 。 ? 一種新的研究策略 ：整合了分離分析、質譜鑒定、生物信息學、分子生物學、細胞生物學 …… 等學科和技術對蛋白質組進行研究。因