【正文】 據(jù)庫搜索目標(biāo)蛋白質(zhì) Shotgun策略 酶解得到肽混合物 多維色譜分離 MS/MS質(zhì)譜鑒定 , 序列分析 MS分析 m/z 譜 比較分析 蛋白質(zhì)功能分析 (western blot、 免疫組織化學(xué)、激光共聚焦顯微技術(shù)、分子生物學(xué)技術(shù) ) Topdown versus bottomup proteomics ? Topdown ? Advantages ? Complete protein sequence access ? PTM location ? No protein digestion required ? Disadvantages ? MS equipments are expensive to purchase and operate ? Does not work well for large proteins (50kDa) ? Limitation in coupling with online separations ? Protein fragmentation poorly understood ? Bottomup ? Advantages ? More mature technique ? Can be fully automated ? Feasible for plicated samples ? Quantification ? Disadvantages ? Partial sequence coverage ? Loss of information of PTMs ? Loss of information about lowabundance proteins 蛋白質(zhì)組學(xué)通常分為 4種研究模式 ? 完全蛋白質(zhì)組學(xué)，是檢測特定細(xì)胞或組織內(nèi)所有蛋白質(zhì)組成、定位、理化參數(shù)等； ? 功能蛋白質(zhì)學(xué)，研究與某一功能相關(guān)的所有蛋白質(zhì)； ? 修飾蛋白質(zhì)組學(xué)，研究蛋白質(zhì)修飾，如甲基化、磷酸化、泛素化等； ? 比較蛋白質(zhì)組學(xué)（差異蛋白質(zhì)組學(xué)），通過比較分析不同狀態(tài)下細(xì)胞或組織蛋白質(zhì)表達(dá)圖譜，著重研究不同生物體在不同時(shí)刻或狀態(tài)下蛋白質(zhì)表達(dá)的變化情況，發(fā)現(xiàn)與特定生理病理狀態(tài)密切相關(guān)的差異表達(dá)蛋白，從而闡明特定生理病理狀態(tài)產(chǎn)生的本質(zhì)規(guī)律。 Pandey A , Mann M. Proteomics to study genes and genomes. Nature ,2022 ,405(6788) :837 846. 比較蛋白質(zhì)組學(xué) ? 比較蛋白質(zhì)組學(xué)（ Comparative Proteomics）針對(duì)不同空間、不同時(shí)間上動(dòng)態(tài)變化著的蛋白質(zhì)組的整體進(jìn)行比較，分析不同蛋白質(zhì)組之間在表達(dá)數(shù)量、表達(dá)水平和修飾狀態(tài)上的差異，可以發(fā)現(xiàn)與病變相關(guān)的特異蛋白質(zhì)。 ? Comparative Proteomics： Study the proteomic changes in different states by identifying differentially expressed proteins and their modification Comparative Proteomics Purposes： Therapeutic target discovery Diagnostic/prognostic marker development Mechanistic study 空間上的差異 時(shí)間上的差異 N D N D N D 0 1000 15 89 1056.1 1326.7 1923.4 2100.6 600 2200 62 76 99 1501.9 1759.8 attttaaaatattcctatttaaaaaaaatgaaatta M K L gatccatcaaaatgtgttcaagtttcaatctctggt ttaaaacaaataaatactcagcttacttgtaatggt gaaccttgtaatactccaacagttacaccaacaaca ccaactggaccattaaaatttaattataaattagat aatgtacactattatcaatatagagttacagtaaca R V A D D Q F R V E D F S I N F Y Y A L A L K S Y D E P C N T P T V T P T T P T G P L K F N Y K L D 比較蛋白質(zhì)組學(xué)的研究模式 starting tissue sample points 2DE map differentially expressed spots peptide MS and MSMS protein sequence metabolic drug targets N D Mass spectrometry 比較蛋白質(zhì)組學(xué)研究具有的優(yōu)勢(shì)： ? 在技術(shù)上有更高的可實(shí)現(xiàn)性，目前的研究技術(shù)還難以把細(xì)胞內(nèi)所有的蛋白質(zhì)展現(xiàn)出來； ? 可以反映蛋白質(zhì)的動(dòng)態(tài)本質(zhì)； ? 具有廣泛和明確的應(yīng)用前景，如疾病生物標(biāo)記物的研究等。 目前蛋白質(zhì)組研究中的主流技術(shù) Proteome Separation ? 1 DE ? 2 DE ? Multidimensional HPLC Bio – mass Spectrometry ? MALDI TOF MS ? ESI MS ? Hybrid MS/MS Bioinformatics ? Databases ? Tools and Softwares 二維電泳圖譜所傳達(dá)的信息 ? 蛋白質(zhì)的分布范圍 (偏酸性或偏堿性 ) ? 表達(dá)蛋白質(zhì)的可能個(gè)數(shù)(凝膠點(diǎn)的數(shù)目 ) ? 蛋白質(zhì)的的大概相對(duì)分子量 ? 蛋白質(zhì)的的大概相對(duì)等電點(diǎn) ? 蛋白質(zhì)相對(duì)表達(dá)豐度(點(diǎn)的灰度值 ) ? 但是，通過二維電泳分離不能得到完整的功能蛋白質(zhì)，得到的是構(gòu)成蛋白質(zhì)的各個(gè)亞基。 pI ～ 200 kDa 人血漿中低豐度蛋白質(zhì)組的 二維電泳圖譜 Standard Method for Complex Peptide Mixture Analysis Cation Exchange RPHPLC ESIMS/MS 質(zhì)譜分析法 (mass spectrometry, MS) ? 是將化合物形成離子和碎片離子，按質(zhì)荷比（ m/z）的不同進(jìn)行分離，來進(jìn)行成分和結(jié)構(gòu)分析的方法。 ? 質(zhì)譜分析中，多種離子化技術(shù)均可使物質(zhì)分子失去外層價(jià)電子形成分子離子（ molecular ion， M+），分子離子中的化學(xué)鍵還可以繼續(xù)發(fā)生某些有規(guī)律的斷裂而形成不同質(zhì)量的碎片離子（ fragment ion）： M →→→ M + + 碎片離子 + 中性分子 質(zhì)譜儀的構(gòu)成 質(zhì)量分析器 檢測器 計(jì)算機(jī) 控制與 數(shù)據(jù)處理 樣品導(dǎo)入系統(tǒng) 離子源 真空泵 I m/z 質(zhì)譜圖 Mass spectrum Inlet System Ion sources Mass analyzers Detector Data system Vacuum Pumping system GCtrap 僅適用于揮發(fā)性物質(zhì)的分析 MALDITOF MS + PSD 測定分子質(zhì)量 , 提供某些結(jié)構(gòu)信息 Ion Trap MS 測定分子質(zhì)量 , 提供詳細(xì)的結(jié)構(gòu)信息 Triple quadrupole LC/MS 定量分析 從復(fù)雜系統(tǒng)中 提取質(zhì)量 2Sector FTICR 從復(fù)雜系統(tǒng)中提取質(zhì)量 提供詳細(xì)的結(jié)構(gòu)信息 高 低 信息量（Information） 100K 200K 300K 400K 500K 600K 儀器價(jià)格（ US￥） LC MS IT TOF LTQ Orbitrap Q TOF TOFTOF 生物信息學(xué) (Bioinformatics) ? 在生命科學(xué)的研究中，以計(jì)算機(jī)為工具對(duì)生物信息進(jìn)行存儲(chǔ)、檢索和分析的一門交叉學(xué)科。通過對(duì)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的獲取、加工、存儲(chǔ)、檢索與分析，進(jìn)而揭示數(shù)據(jù)所蘊(yùn)含的生物學(xué)意義。 ? 生物信息學(xué)主要研究兩種信息載體 (DNA分子 ,蛋白質(zhì)分子 ) ? 研究內(nèi)容： ? 基因組生物信息學(xué) ? 蛋白質(zhì)組生物信息學(xué) ? 代謝調(diào)控生物信息學(xué) Computational approaches to answer biological questions 生物信息學(xué)的基本架構(gòu) 染色體 基因組圖譜 基因組數(shù)據(jù)庫 核酸 DNA序列 核酸序列數(shù)據(jù)庫 蛋白質(zhì)序列 蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu) 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫 蛋白質(zhì) 基因組作圖 序列測定 結(jié)構(gòu)測定 生物信息學(xué) 數(shù)據(jù)庫工具 生物信息學(xué) 數(shù)據(jù)庫工具 二次數(shù)據(jù)庫；復(fù)合數(shù)據(jù)庫 ? 自 1993年起， Nucleic Acids Research 每年都會(huì)在第一期推出生物數(shù)據(jù)庫特刊，介紹上一年度的數(shù)據(jù)庫增加和更新情況。 全球蛋白資源數(shù)據(jù)庫 UniProt ? UniProt是目前為止收錄蛋白質(zhì)序列目錄最廣泛、功能注釋最全面的一個(gè)數(shù)據(jù)庫。 ? UniProt由歐洲生物信息學(xué)研究所（ European Bioinformatics Institute）、美國蛋白質(zhì)信息資源（ Prontein Information Resource）以及瑞士生物信息研究所（ Swiss Institute of Bioinformatics）等機(jī)構(gòu)共同組成的 UniProt協(xié)會(huì)（ UniProt Consortium）管理。 ? UniProt向所有使用者免費(fèi)開放，全球科研人員都可以登陸網(wǎng)站 。 專家評(píng)說蛋白質(zhì)組學(xué) ? 2022年 10月 25日，在北京開幕的第三屆國際人類蛋白質(zhì)組大會(huì)上，時(shí)任 HUPO主席、加拿大 McGill大學(xué)解剖與細(xì)胞生物學(xué)系主任 John Bergeron教授說，人類基因組圖譜完成后，科學(xué)家意識(shí)到，絕大部分基因及功能還需要從蛋白質(zhì)水平予以詮釋和解讀。因?yàn)榛蚪M只能決定生命體的基本形式，蛋白質(zhì)組才能決定生命體的多樣性、復(fù)雜性及其功能。 ? 開展蛋白質(zhì)組研究工作，是科學(xué)界延續(xù)了數(shù)十年的一個(gè)夢(mèng)想，因?yàn)槿祟惖拇蠖鄶?shù)疾病是由于蛋白質(zhì)異常造成的。 ? 當(dāng)二維電泳、新型質(zhì)譜技術(shù)及各種先進(jìn)的生物信息和網(wǎng)絡(luò)技術(shù)為科學(xué)家掌握蛋白質(zhì)表達(dá)規(guī)律提供了有力支撐，并且在人類基因組研究實(shí)現(xiàn)劃時(shí)代飛躍的時(shí)候，蛋白質(zhì)組學(xué)便被推上前臺(tái)。 專家評(píng)說蛋白質(zhì)組學(xué) ? 而前任 HUPO主席 Samir Hanash教授說：“如果說人類基因組計(jì)劃是把人類送入太空，蛋白質(zhì)組計(jì)劃則是促使人類返回地球?！? “現(xiàn)在，我們已經(jīng)把一個(gè)人送進(jìn)宇宙飛船，飛船還在太空中飛了一圈，但至于它什么時(shí)候著陸，我們不知道，還需要我們付出巨大的努力?！? HUPO現(xiàn)任主席 ? Rolf Apweiler – President amp。 Chairman of the Board（ ） . ? Rolf Apweiler 是 EMBL的資深專家（ Senior Scientist）和歐洲生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫（ EBI?s Sequence Database group）的負(fù)責(zé)人。由此可以看出，在蛋白質(zhì)組學(xué)的未來發(fā)展中，HUPO對(duì)于生物信息學(xué)的重視。 總結(jié)：對(duì)于蛋白質(zhì)組學(xué)的認(rèn)識(shí) ? 一種新的學(xué)術(shù)思想 ：以系統(tǒng)生物學(xué)的思想對(duì)蛋白質(zhì)組進(jìn)行研究，詮釋 生命體的多樣性、復(fù)雜性及其功能。 。 ? 一種新的研究策略 ：整合了分離分析、質(zhì)譜鑒定、生物信息學(xué)、分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué) …… 等學(xué)科和技術(shù)對(duì)蛋白質(zhì)組進(jìn)行研究。因