蛋白質(zhì)的分離、純化和表征-資料下載頁
2025-04-30 06:38本頁面
【正文】 y 離子交換層析是以 離子交換劑 為 固定相 ，依據(jù)流動(dòng)相中的 不同帶電組分 與交換劑上的平衡離子進(jìn)行可逆交換時(shí)的能力的差別（與離子交換劑結(jié)合力的差別）而進(jìn)行分離的一種層析方法。 離子交換層析是生物化學(xué)領(lǐng)域中常用的一種層析方法，廣泛的應(yīng)用于各種生化物質(zhì)如氨基酸、蛋白、糖類、核苷酸 等的分離純化。 蛋白質(zhì)的分離純化方法 Ion Exchange Chromatography ?纖維素離子交換劑 ?交聯(lián)葡聚糖離子交換劑 ? 鹽濃度的微小變化就會(huì)直接影響它對(duì)蛋白質(zhì)電荷吸附容量 。 因此 ， 蛋白質(zhì)混合物的分離可以由改變?nèi)芤褐械柠}離子強(qiáng)度和 pH來完成 。 梯度混合器 蛋白質(zhì)的分離純化方法 Ion Exchange Chromatography 離子交換層析的原理 ? 離子交換層析是依據(jù)各種離子或離子化合物與離子交換劑的結(jié)合力不同而進(jìn)行分離純化的 。 ? 離子交換層析的固定相是離子交換劑 ， 它是由一類不溶于水的惰性高分子聚合物基質(zhì)通過一定的化學(xué)反應(yīng)共價(jià)結(jié)合上某種電荷基團(tuán)形成的 。 + + + 高分子聚合物基質(zhì) 電荷基團(tuán) 平衡離子 蛋白質(zhì)的分離純化方法 離子交換層析的原理 蛋白質(zhì)的分離純化方法 離子交換層析系統(tǒng)的組成 蛋白質(zhì)的分離純化方法 離子交換層析的操作流程 1。 離子交換劑的選擇和預(yù)處理 2。裝柱 3。 平衡 4。加樣和淋洗 5。洗脫 6。 收集、鑒定及保存 7?；|(zhì)的再生 蛋白質(zhì)的分離純化方法 ? 利用選擇性吸附的純化方法 ? 吸附層析是利用待純化的分子和雜質(zhì)分子與吸附劑之間的 吸附能力 和 解吸性質(zhì) 不同而達(dá)到分離目的 。 ? 材料：硅膠 （ 硅烷醇 SiOH） ? 氧化鋁 ? 活性炭 蛋白質(zhì)的分離純化方法 ? 羥基磷灰石層析 ? 結(jié)晶磷酸鈣 ? 分離蛋白質(zhì)、核酸 蛋白質(zhì)的分離純化方法 ? 疏水作用層析 ? 蛋白質(zhì)存在于分子表面的疏水氨基酸殘基的數(shù)量是不同的 。 ? 連接在支持介質(zhì) （ 如瓊脂糖 ） 上的 疏水基團(tuán) 與蛋白質(zhì)表面上暴露的 疏水基團(tuán) 結(jié)合 。 ? 使用逐漸降低離子強(qiáng)度或增加 pH的洗脫液 。 蛋白質(zhì)的分離純化方法 ? 利用對(duì)配體的特異生物學(xué)親和力的純化方法 親和層析 (Affinity Chromatography) 蛋白質(zhì)的分離純化方法 (2) Specific Binding Substance (B) 溶 離 Elution (4) 配 體 Ligand (A) 耦合反應(yīng) (3) Coupling Reaction 雜 質(zhì) B B B B (1) Solid Matrix B 親和層析的原理 蛋白質(zhì)的分離純化方法 Affinity Chromatography ? Affinity chromatography exploits the specific, high affinity, noncovalent binding of a protein to another molecule, the ligand. ? First, the ligand is covalently attached to an inert（惰性的） and porous matrix（基質(zhì)） . ? The protein mixture is then passed down a column containing the immobilized（固定化的） ligand. ? The protein of interest will bind to the ligand, whereas all other proteins pass straight through the column. Affinity Chromatography ? After extensive washing of the column with buffer to remove nonspecifically bound proteins, the bound protein is release from the immobilized ligand either by adding soluble ligand which petes with the immobilized ligand for the protein, or by altering the properties of the buffer (changing the pH or salt concentration) Affinity Chromatography 固相擔(dān)體 (1) (2) (3) A B Sample Washing Elution X B 親和基團(tuán) 配體 X B A A 親和層析的原理 蛋白質(zhì)的分離純化方法 Activity Protein 改變洗脫條件 * Elution volume 親和層析的原理 蛋白質(zhì)的分離純化方法 加樣淋洗 親和層析的 應(yīng)用 1. 抗原和抗體 蛋白質(zhì)的分離純化方法 ? 高效液相層析和 快速蛋白液相層析 ? 是離子交換 、 分子排阻 、 吸附和分配等層析技術(shù)的發(fā)展 。 ? 對(duì)柱層析來說 ， 載體的 顆粒愈小 、 則 分辨率愈高 ， 但是洗脫液的 流速也愈慢 。 為解決這一矛盾 ， 采用 高壓 和 顆粒度小 而均勻 、 機(jī)械性能強(qiáng) 、化學(xué)性能穩(wěn)定的固定項(xiàng)以及其他相應(yīng)的設(shè)備 。 蛋白質(zhì)的分離純化方法 蛋白質(zhì)的含量測(cè)定與純度鑒定 實(shí)用中經(jīng)常是多種方法聯(lián)合使用 ? 蛋白質(zhì)的含量測(cè)定與純度鑒定 ? 蛋白質(zhì)含量測(cè)定 ? 凱氏定氮法 ? 雙縮脲法 ? Folin—酚試劑法 （ Lowry法 ） ? 紫外吸收法 ? 染料結(jié)合法 (Bradford法 ) ? 膠體金測(cè)定法 ? 蛋白質(zhì)純度測(cè)定 ? 電泳 ? 等電聚焦 , PAGE, SDSPAGE, 毛細(xì)管電泳 ? 純的蛋白呈一條帶或峰 ? 沉降 ? 純的蛋白以單一沉降速度運(yùn)動(dòng) ? HPLC ? 純的蛋白為單一的對(duì)稱峰 ? 溶解度分析 ? 純的蛋白質(zhì)溶解曲線只呈現(xiàn)一個(gè)折點(diǎn) 蛋白質(zhì)的含量測(cè)定與純度鑒定 、純化和表征作業(yè) ?名詞解釋 ?等離子點(diǎn) ， 沉降系數(shù) ， 鹽析 ， 鹽溶 ， ?密度梯度離心 ， 透析 ， 超過濾 ? Gel Filtration Chromatography ? SDAPAGE， Isoelectric focusing ? Ion Exchange Chromatography ? Affinity Chromatography ?回答問題： ? 、溶解度不同、電荷不同分離蛋白質(zhì)的方法都有哪些 ? ? ？ ? 3. 書 p317 第 1， 5， 7， 8題 ?From “Biochemstry” ? 4. 翻譯 B4 Myoglobin and Hemoglobin(p4855) ? 翻譯 Key Notes 、純化和表征作業(yè) THE END
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