蛋白質(zhì)的修飾和表達(dá)(已修改)
2025-01-24 07:36 本頁面
【正文】 二、蛋白質(zhì)功能的全新設(shè)計(jì) ? 蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)的目標(biāo)是產(chǎn)生既能折疊為預(yù)想的結(jié)構(gòu)和有用的功能。功能設(shè)計(jì)主要涉及鍵合及催化 ? 為達(dá)到這些目的可以采用兩條不同的途徑：反向?qū)崿F(xiàn)蛋白質(zhì)與工程底物的契合，改變功能；從頭設(shè)計(jì)功能蛋白質(zhì) 蛋白質(zhì)的功能設(shè)計(jì) １．通過反向擬合天然蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)新的功能 ２．鍵合及催化的從頭設(shè)計(jì) ３．在全新蛋白質(zhì)中引入結(jié)合位點(diǎn) ４．催化活性蛋白質(zhì)的設(shè)計(jì) ５．膜蛋白及離子通道的設(shè)計(jì) ６．新材料的設(shè)計(jì) ? 蛋白質(zhì)修飾的化學(xué)途徑 ? 蛋白質(zhì)修飾的分子生物學(xué)途徑 第四章 蛋白質(zhì)的修飾和表達(dá) 氨基的化學(xué)修飾 ? 三硝基苯磺酸與賴氨酸殘基反應(yīng)，在 420nm和 367nm能夠產(chǎn)生特定的光吸收。 ? 亞氨代乙酰基：亞氨代乙?；磻?yīng)可區(qū)分 α氨基和 ε氨基。完全亞氨代乙?；牡鞍踪|(zhì)仍保持在水溶液中的可溶性。 ? α異硫氰酸苯酯在嚴(yán)格控制的條件下可對(duì) α氨基進(jìn)行相當(dāng)特異性的修飾，而不作用于 ε氨基。 羧基的化學(xué)修飾 ? 由于羧基在水溶液中的化學(xué)性知識(shí)的蛋白質(zhì)分子中的谷氨酸和天冬氨酸的修飾方法很有限，產(chǎn)物一般是酯類或酰胺類。水溶性的碳化二亞胺類特定修飾羧基基團(tuán)，可在較溫和的條件進(jìn)行 氧化和還原反應(yīng) ? 二硫鍵的還原： 2巰基乙醇、巰基乙酸和二硫蘇糖醇等。 ? 判斷蛋白質(zhì)分子中有無二硫鍵，是鏈內(nèi)二硫鍵還是鏈間二硫鍵的方法可用非還原 /還原雙向 SDSPAGE電泳技術(shù)。處理后的蛋白很容易自動(dòng)氧化，重新形成二硫鍵，因而需要經(jīng)過羧甲基處理，防止重新形成二硫鍵。 ? 5， 5’二硫 2硝基苯甲酸（ DTNB）（ Ellman試劑），可與巰基反應(yīng)形成二硫鍵，使蛋白質(zhì)分子上標(biāo)記 1個(gè) 2硝基 5硫苯甲酸（ TNB），同時(shí)釋放 1個(gè)有很強(qiáng)顏色的 TNB陰離子，可在 412nm處通過光吸收的變化來監(jiān)測(cè)反應(yīng)的程度。Ellman是目前常用的定量測(cè)定蛋白質(zhì)分子巰基數(shù)目試劑，還被用于探測(cè)蛋白質(zhì)分子去折疊與再折疊時(shí)的構(gòu)象變化狀態(tài)及跟蹤構(gòu)象變化的過程。 化學(xué)修飾影響的條件 ? 溫和的反應(yīng)條件是防止蛋白質(zhì)分子變性的一個(gè)必要條件 ? pH值得變化：決定了具有潛在反應(yīng)能力的基團(tuán)所處的可反應(yīng)和不可反應(yīng)的離子狀態(tài)。 ? 溫度：影響活性巰基的微環(huán)境 ? 有機(jī)溶劑：試劑需要有機(jī)溶劑來助溶，但有機(jī)溶劑可使蛋白質(zhì)變性。 ? 化學(xué)方法： 產(chǎn)生半合成的結(jié)構(gòu)，一個(gè)天然多肽與一個(gè)人造（或化學(xué)修飾）的多肽相締合 非共價(jià)締合 產(chǎn)生二硫鍵 形成肽鍵 產(chǎn)生非天然型的共價(jià)鍵 ? 非共價(jià)締合 在多肽鏈中如果出現(xiàn)一個(gè)切口，但多肽鏈并不因此分開，仍能保持其生物學(xué)活性。在變性系統(tǒng)中，破壞非共價(jià)鍵后，在非變性基質(zhì)中仍可形成原來的構(gòu)型，活力也隨之恢復(fù)。這一現(xiàn)象可用來產(chǎn)生半合成的類似物 ? 產(chǎn)生二硫鍵 二硫鍵被還原劑打開，多肽彼此分開 DTT、 二硫蘇糖醇 將這些片斷與適當(dāng)?shù)谋恍揎椀幕蚝铣傻牧硪浑南嗷旌?，通過重新形成二硫鍵而形成嵌合分子 ? 形成肽鍵 通過酶連接反應(yīng)形成肽鍵 從豬胰島素生產(chǎn)人胰島素 將 B鏈丙氨酸殘基改為蘇氨酸殘基（胰蛋白酶） 通過酶法與活性酯偶聯(lián) 羥基琥珀酰亞胺酯作為接頭分子 ? 產(chǎn)生非天然型共價(jià)鍵 利用雙功能試劑可以將不同的蛋白質(zhì)連在一起。常用的方法是將雙功能的接頭與兩個(gè)蛋白質(zhì)分子中的賴氨酸殘基側(cè)鏈相連接。 可以用主鏈肟鍵產(chǎn)生尾 尾相連二聚體 如：抗體 制備具有不同功能的 F（ ab)2的類似物 ? 蛋白質(zhì)改造的分子生物學(xué)方法 突變： 寡核苷酸介導(dǎo)的定向
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