蛋白質的修飾和表達-展示頁
2025-01-21 07:36本頁面
【正文】 5’端磷酸化的突變寡核苷酸引物 ,與待突變的核苷酸形成一小段堿基錯配的異源雙鏈的 DNA, 合成突變鏈 :在 DNA聚合酶的催化下 ,引物以單鏈 DNA為模板合成全長的互補鏈 ,而后由連接酶封閉缺口 ,產生閉環(huán)的異源雙鏈的 DNA分子 。常用的方法是將雙功能的接頭與兩個蛋白質分子中的賴氨酸殘基側鏈相連接。在變性系統(tǒng)中，破壞非共價鍵后，在非變性基質中仍可形成原來的構型，活力也隨之恢復。 ? 溫度：影響活性巰基的微環(huán)境 ? 有機溶劑：試劑需要有機溶劑來助溶，但有機溶劑可使蛋白質變性。Ellman是目前常用的定量測定蛋白質分子巰基數(shù)目試劑，還被用于探測蛋白質分子去折疊與再折疊時的構象變化狀態(tài)及跟蹤構象變化的過程。處理后的蛋白很容易自動氧化，重新形成二硫鍵，因而需要經過羧甲基處理，防止重新形成二硫鍵。水溶性的碳化二亞胺類特定修飾羧基基團，可在較溫和的條件進行 氧化和還原反應 ? 二硫鍵的還原： 2巰基乙醇、巰基乙酸和二硫蘇糖醇等。 ? α異硫氰酸苯酯在嚴格控制的條件下可對 α氨基進行相當特異性的修飾，而不作用于 ε氨基。 ? 亞氨代乙酰基：亞氨代乙?；磻蓞^(qū)分 α氨基和 ε氨基。 二、蛋白質功能的全新設計 ? 蛋白質設計的目標是產生既能折疊為預想的結構和有用的功能。功能設計主要涉及鍵合及催化 ? 為達到這些目的可以采用兩條不同的途徑：反向實現(xiàn)蛋白質與工程底物的契合，改變功能；從頭設計功能蛋白質 蛋白質的功能設計 １．通過反向擬合天然蛋白質設計新的功能 ２．鍵合及催化的從頭設計 ３．在全新蛋白質中引入結合位點 ４．催化活性蛋白質的設計 ５．膜蛋白及離子通道的設計 ６．新材料的設計 ? 蛋白質修飾的化學途徑 ? 蛋白質修飾的分子生物學途徑 第四章 蛋白質的修飾和表達 氨基的化學修飾 ? 三硝基苯磺酸與賴氨酸殘基反應，在 420nm和 367nm能夠產生特定的光吸收。完全亞氨代乙?；牡鞍踪|仍保持在水溶液中的可溶性。 羧基的化學修飾 ? 由于羧基在水溶液中的化學性知識的蛋白質分子中的谷氨酸和天冬氨酸的修飾方法很有限，產物一般是酯類或酰胺類。 ? 判斷蛋白質分子中有無二硫鍵，是鏈內二硫鍵還是鏈間二硫鍵的方法可用非還原 /還原雙向 SDSPAGE電泳技術。 ? 5， 5’二硫 2硝基苯甲酸（ DTNB）（ Ellman試劑），可與巰基反應形成二硫鍵，使蛋白質分子上標記 1個 2硝基 5硫苯甲酸（ TNB），同時釋放 1個有很強顏色的 TNB陰離子，可在 412nm處通過光吸收的變化來監(jiān)測反應的程度。 化學修飾影響的條件 ? 溫和的反應條件是防止蛋白質分子變性的一個必要條件 ? pH值得變化：決定了具有潛在反應能力的基團所處的可反應和不可反應的離子狀態(tài)。 ? 化學方法： 產生半合成的結構，一個天然多肽與一個人造（或化學修飾）的多肽相締合 非共價締合 產生二硫鍵 形成肽鍵 產生非天然型的共價鍵 ? 非共價締合 在多肽鏈中如果出現(xiàn)一個切口，但多肽鏈并不因此分開，仍能保持其生物學活性。這一現(xiàn)象可用來產生半合成的類似物 ? 產生二硫鍵 二硫鍵被還原劑打開，多肽彼此分開 DTT、 二硫蘇糖醇 將這些片斷與適當?shù)谋恍揎椀幕蚝铣傻牧硪浑南嗷旌?，通過重新形成二硫鍵而形成嵌合分子 ? 形成肽鍵 通過酶連接反應形成肽鍵 從豬胰島素生產人胰島素 將 B鏈丙氨酸殘基改為蘇氨酸殘基（胰蛋白酶） 通過酶法與活性酯偶聯(lián) 羥基琥珀酰亞胺酯作為接頭分子 ? 產生非天然型共價鍵
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