蛋白質(zhì)的分離純化和表征(編輯修改稿)
2025-05-27 06:38 本頁(yè)面
【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 小分子 Ve1 Ve2 V0 蛋白質(zhì) Mr=49,000 洗出液中的蛋白質(zhì)濃度 洗脫體積（ mL） 未知 logMr 洗脫體積與相對(duì)分子質(zhì)量的關(guān)系 Andrews的經(jīng)驗(yàn)公式： logMr=K1K2(Ve/Vo) 球蛋白 Mr“ 選擇性曲線 ” G200 G100 logMr Kav （二） 利用溶解度差別的 純化方法 ? ◇ PH控制 ? ◇ ? ◇ ? ◇ PH控制 ? 蛋白質(zhì)處于等電點(diǎn)時(shí)，其凈電荷為零，由于相鄰蛋白質(zhì)分子之間沒(méi)有靜電斥力而趨于聚集沉淀。因此在其他條件相同時(shí)，它的溶解度達(dá)到最低點(diǎn)。在等電點(diǎn)以上或以下的 pH時(shí)，蛋白質(zhì)分子攜帶同種符號(hào)的凈電荷而相互排斥，阻止了單個(gè)分子聚集成沉淀，因此溶解度較大。在其等電點(diǎn) (pH )時(shí)達(dá)到最低值，在等電點(diǎn)兩側(cè)的 pH下，其溶解度迅速上升；不同的蛋白質(zhì)具有不同的等電點(diǎn)，利用蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)時(shí)溶解度最低的原理，可以把蛋白質(zhì)混合物分開。 ? 當(dāng) pH被調(diào)至蛋白質(zhì)混合物中某種成分的等電點(diǎn) pH時(shí)，這種蛋白質(zhì)的大部分或全部將沉淀下來(lái)，那些等電點(diǎn)高于或低于該 pH的蛋白質(zhì)則仍留在溶液中這樣沉淀出來(lái)的蛋白質(zhì)保持著天然構(gòu)象，能重新溶解于適當(dāng)?shù)?pH和一定濃度的鹽溶液中。 ? 低濃度的中性鹽可以增加蛋白質(zhì)的溶解度，這種現(xiàn)象稱為鹽溶 (salting in), ? 鹽溶作用主要是由于蛋白質(zhì)分子吸附某種鹽類離子后，帶電層使蛋白質(zhì)分子彼此排斥，而蛋白質(zhì)分子與水分子間的相互作用卻加強(qiáng)，因而溶解度增高。球蛋白溶液在透析過(guò)程中往往沉淀析出，這就是因?yàn)橥肝龀チ他}類離子，使蛋白質(zhì)分子間的相互吸引增加，引起蛋白質(zhì)分子的凝集并沉淀。表明中性鹽對(duì)球狀蛋白質(zhì)的溶解度有顯著的影響。 ? （ 1）有機(jī)溶劑可以使蛋白質(zhì)沉淀 主要有乙醇、丙酮、乙酸乙酯等。 ? （ 2）有機(jī)溶劑可以破壞水化膜、造成一個(gè)低介電區(qū)。 ? （ 3）有分級(jí)分離現(xiàn)象 ? （ 4）要求對(duì)有機(jī)溶劑低溫預(yù)冷。 ? 在一定溫度范圍內(nèi)，約 040℃ 之間，大部分球狀蛋白質(zhì)的溶解度隨溫度升高而增加，但也有例外，例如人的血紅蛋白從 0到 25℃ ，溶解度隨溫度上升而降低。在 4050℃ 以上開始變性，一般在中性 pH介質(zhì)中即失去溶解力。大多數(shù)蛋白質(zhì)在低溫下比較穩(wěn)定，因此蛋白質(zhì)的分級(jí)分離操作一般都在 0 ℃ 或更低的溫度下進(jìn)行。 （三）根據(jù)電荷不同的純化方法 ? ◇ ? ◇ ? ◇ ? ◇ ? ◇ ? ◇ ? 電泳分離蛋白質(zhì)是根據(jù)蛋白質(zhì)在電場(chǎng)中的遷移的差別達(dá)到分離目的的。蛋白質(zhì)樣品加到一塊預(yù)先制好的凝膠介質(zhì)上，只要在凝膠的兩端加上電場(chǎng)，就可以達(dá)到分離蛋白質(zhì)的目的，這樣的電泳稱之凝膠電泳（ gel electrophoresis）。凝膠可以是淀粉凝膠（ starch gel）、瓊脂糖凝膠（ agarose gel）和聚丙烯酰胺凝膠（ polyacrylamide gel）。一般凝膠介質(zhì)中的 pH被維持在堿性區(qū)，目的是使大多數(shù)蛋白質(zhì)都帶有負(fù)電荷，這樣它們可以向陽(yáng)極遷移。蛋白質(zhì)的遷移與蛋白質(zhì)的質(zhì)量和帶電荷的多少有關(guān)。 電泳技術(shù)分類 垂直板電泳 毛細(xì)管電泳 水平板電泳 電泳支持物 濾紙 凝膠 薄膜 圓盤電泳 ? 聚丙烯酰胺凝膠電泳（ polyacrylamide gel electrophoresis,簡(jiǎn)稱 PAGE)，也稱圓盤凝膠電泳或圓盤電泳 (disc gel electrophoresis)，它是在區(qū)帶電泳的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的。它以聚丙烯 Ift胺凝膠為支持物，一般制成凝膠柱或凝膠板，凝膠是由相連的二部分組成（小的部分是濃縮膠，大的部分是分離膠），這二部分凝膠的濃度（孔徑大小）、緩沖液組分和離子強(qiáng)度 ,pH以及電場(chǎng)強(qiáng)度都是不同的，即不連續(xù)的。這樣 ,電泳時(shí)樣品首先在不連續(xù)的兩相間積聚濃縮而成很薄的起始區(qū)帶（厚度約為 mm），然后再進(jìn)行電泳分離。 ? PAG是用丙烯酰胺 (acrylamide， Acr)和交聯(lián)劑亞甲基雙丙烯酰胺 (N， N?methylen。 bisacrylamide， Bis)在催化劑的作用下聚合而成，聚合反應(yīng)的催化系統(tǒng)有兩種。 ? 化學(xué)聚合 :催化劑過(guò)硫酸銨 (AP)，加速劑 TEMED ? 光聚合 :催化劑核黃素，加速劑 TEMED ? ?不連續(xù) PAGE三種效應(yīng)：電荷效應(yīng)、分子篩效應(yīng)和濃縮效應(yīng) 毛細(xì)管電泳又稱毛細(xì)管區(qū)帶電泳 ， 它是在毛細(xì)管 （ ?275μ m） 中裝入緩沖液 ， 從其一端注入樣品 ， 在毛細(xì)管兩端加高壓直流電實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品的分離， 分離后的樣品依次通過(guò)設(shè)在毛細(xì)管一端的檢測(cè)器檢出 。 該法克服了傳統(tǒng)區(qū)帶電泳的熱擴(kuò)散和樣品擴(kuò)散的問(wèn)題 ， 實(shí)現(xiàn)了快速和高效分離 。 毛細(xì)管電泳是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)新技術(shù)，被認(rèn)為是 90年代最有影響的分離手段之一。目前已廣泛用于氨基酸分析、蛋白質(zhì)高效分離、指紋圖譜研究、分離合成的寡核苷酸、 DNA序列測(cè)定及 PCR產(chǎn)物的分析鑒定等。
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