【文章內(nèi)容簡介】 而被 置換 ?添加置換劑 能 置換 基質(zhì)上 所有蛋白質(zhì) 洗脫方法 階段洗脫和梯度洗脫 洗脫速度 洗脫速度通常要保持 恒定 洗脫速度慢：分辨率高，但洗脫峰寬 洗脫速度快：洗脫峰窄，但分辨率下降 洗脫液的監(jiān)測收集及組分鑒定 監(jiān)測 用紫外檢測儀進行，在 280nm處觀察洗脫液的光吸收 收集 用分步收集器收集，可以自動收集，也可以手動收集 鑒定 聚丙烯酰胺凝膠電泳、測定活性等 離子交換劑的清洗、再生和保存 清洗 ?可溶于堿的污染物 mol/L NaOH洗滌 MilliQ純化的蒸餾水洗滌 結(jié)合緩沖液洗滌 可以除去諸如脂類、蛋白質(zhì)和核酸這類的污染物。 ?對于疏水性污染物 乙醇溶液（如 70%的乙醇）或非離子型的去污劑洗滌 可以除去脂類和其他的疏水性物質(zhì)。 → → 清洗 ?金屬污染物 EDTA飽和的 10 mmol/L HCl（即 pH=2）處理柱子 ?沉淀物雜質(zhì) 去污劑、尿素和鹽酸胍，可將柱子在 6 mol/L 的尿素中平衡和溫育，然后用去離子水和緩沖液洗滌。 再生 對使用過的離子交換劑進行處理，使其恢復(fù)原來性狀的過程。 酸堿交替浸泡：陽離子型交換劑最后用NaOH處理，陰離子型交換劑最后用 HCl處理。 保存 處理洗凈蛋白等雜質(zhì)后，加入適當?shù)姆栏瘎?，一般加? %的疊氮鈉， 4176。 C下 保存。 （四）應(yīng)用實例 陰離子交換層析 從人血漿中分離得到血清白蛋白 (HSA)和免疫球蛋白 G(IgG) 25mmol／ L的乙酸鈉緩沖液充分透析血漿 用乙酸將血漿的 pH調(diào)至 ，除去沉淀 上陰離子交換柱 pH Ig G pH為 ，以階段洗脫的方式得到 HSA 降低 pH至 ，同時升高緩沖液的濃度至 150 mmol /L， 洗脫得到其他的糖蛋白 ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ 用 DEAESepharose CL6B柱大量分級人血漿蛋白 陽離子交換層析 用 CM纖維素分離雞蛋清中的蛋白質(zhì)組份 表 雞蛋清中一些蛋白質(zhì)用 CM纖維素分離結(jié)果的分析 級分中的蛋白質(zhì) pI 洗脫緩沖液的pH 洗脫峰 pH 產(chǎn)量（ mg） 活性回收（ %） A．擬卵粘蛋白 87 B．擬卵粘蛋白 C．卵蛋白 A1 89 D．卵蛋白 A2 E．卵蛋白 A3 F．“球蛋白” G．卵轉(zhuǎn)鐵蛋白 87 H．卵轉(zhuǎn)鐵蛋白 I．“球蛋白” J．“球蛋白” K．“球蛋白” L．抗生物素蛋白 10 39 M．“球蛋白” N．溶菌酶 92 三、凝膠過濾層析 (exclusion chromatography) 凝膠層析又稱分子篩過濾、排阻層析等，依據(jù)是 多孔的載體對不同體積和不同形狀分子的排阻能力的不同 ， 從而對混合物進行分離。 優(yōu)點： 凝膠屬于惰性載體，不帶電荷，吸附力弱，操作條件比較溫和，溫度范圍廣，不需要有機溶劑，分離效果好 缺點： 樣品被不斷稀釋，上樣量不能太大，否則分辨率變差 （一）原理 凝膠是一種 不帶電的具有三維空間的 多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的物質(zhì)，每個顆粒的細微結(jié)構(gòu)及篩孔的直徑均勻一致， 小分子可以進入凝膠網(wǎng)孔 ，而 大分子則排阻于顆粒之外 。 大分子 物質(zhì)沿凝膠顆粒間隙隨洗脫液移動，流程短，移動速率快，先被洗出 層析柱 小分子 物質(zhì)可通過凝膠網(wǎng)孔進入顆粒內(nèi)部，然后再擴散出來，故流程長，移動速度慢，最后被洗出層析柱 體積參數(shù) 分子在柱中移動的速度取決于該分子在固定相和流動相間的分配系數(shù) Kd， Kd表示某一分子在特定的凝膠柱內(nèi)的洗脫行為。 Kd＝ (VeVo)／ Vi ?Ve 洗脫體積 ?Vo 外水體積 ?Vi 內(nèi)水體積 Ve=Vo 該成分的分子全部被排阻在凝膠顆粒的間隙中，因而 洗脫速度最快 。即該成分的 Kd＝ 0。 Ve＝ Vi+Vo 該成分不被排阻而可完成進入凝膠顆粒內(nèi)部 , 因而 洗脫速度最慢 。即該成分的 Kd=l。 Kd值介于 0l之間， 物質(zhì)的洗脫速度隨其 Kd值的 增加而降低。 一般物質(zhì)的 Kd值是 0Kd l。 洗脫行為可以有三種可能的情況 : 凝膠 Kd＝ 0 Kd=l 0Kd l ﹡ Kd＝ (VeVo)／ Vi 影響分離效果的因素 流速 加樣體積 樣品濃度 離子強度 ① 流速 ?影響洗脫液流速的因素 ?洗脫液加在柱上的 壓力 為保持層析過程中恒定的壓力，可使用恒壓瓶。 ?凝膠 交聯(lián)度 ?凝膠 顆粒大小 流速 過低 樣品橫向擴散增大， 峰變寬 ，分辨率降低，洗脫時間長 流速 過高 洗脫 峰重疊 ，柱壓增大，分離效果變差 線性流速控制在 2～ 10cm/h ② 加樣體積 體積 過大 平臺洗脫峰或相鄰 峰重疊 體積過小 目的蛋白 收集量少 、稀釋倍數(shù)大、 濃度低 ③ 樣品濃度 進樣前，樣品應(yīng) 高度濃縮 ，濃度為 10～ 20mg/ml 分組分離 amp。脫鹽除雜 適當提高樣品濃度 分級分離 amp。分析性實驗 濃度低 ④ 離子強度 可防止蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間或與凝膠介質(zhì)之間的相互作用 常用鹽溶液： 20100mmol/L NaCl 濃度過高 引起凝膠柱床體積變化 （二）凝膠過濾層析的介質(zhì) 葡聚糖系列 瓊脂糖系列 聚丙烯酰胺系列 多孔硅膠 葡聚糖系列 以微生物產(chǎn)生的 葡聚糖 Dextran為原料 用 環(huán)氧氯丙烷為交聯(lián)劑 ，在堿性條件下交聯(lián)而成商品的凝膠，稱為 Sephadex 葡聚糖凝膠 (Sephadex )的物理特性 品 名 干膠顆粒 直徑 /μm 得水值 Wf/ 床體積 / 最適分段分離范圍 溶脹所需 時間 /h 最大流體 靜力壓 /Pa (cmH2O) 球蛋白分 子質(zhì)量／ Da 線性葡聚糖 分子質(zhì)量 /Da 20℃ lOO ℃ Sephadex G1O 40120 177。 23 700 700 3 1 9810(100) Sephadex G15 40120 177。 1500 1500 3 1 9810(100) Sephadex G25 粗 中粗 細 超細 100300 50150 2080 1040 177。 46 10005000 1005000 6 2 9810(100) Sephadex G50 粗 中粗 細 超細 100300 50150 2080 1040 177。 911 150030000 50010000 6 2 9810(100) Sephadex G75 中粗 超細 40120 1040 177。 1215 300070000 100050000 24 3 4905(50) Sephdex G100 中粗 超細 40120 1040 10177。 1520 4000150000 1000100000 48 5 3434(35) Sephadex G150 中粗 超細 40120 1040 15177。 2030 5000400000 1000150000 72 5 1472(15) Sephadex G200 中粗 超細 40120 1040 20177。 3040 5000800000 1000202200 72 5 981(10) 瓊脂糖系列 較常用的是 Pharmacia和 BioRad兩家的產(chǎn)品，前者生產(chǎn)的稱為 Sepharose，后者的產(chǎn)品為 BioGel A。 BioGel A 系列的產(chǎn)品有不同的顆粒度，有粗、中和細三檔，它們的顆粒度分別為 l50μm～ 300 μm，80μm～ 150μm和 40μm～ 80μm 。 聚丙烯酰胺系列 由丙烯酰胺單體和雙丙烯酰胺混合物聚合得到的多孔性物質(zhì)。 先制成丙烯基的衍生物，然后再用 N， N’甲叉雙丙烯酰胺交聯(lián)，得到商品化的凝膠， 產(chǎn)物也是固體粉末，用前先溶漲。 較常用的是 Pharmacia和 BioRad兩家的產(chǎn)品，前者生產(chǎn)的稱為 Sephacryl ，后者的產(chǎn)品為BioGel P。 多孔硅膠 ?優(yōu)點： 物理化學 穩(wěn)定性高 ， 耐熱耐壓 ，使用 壽命長 ?缺點： 柱效較低 、表面具有離子性，對蛋白質(zhì)有 吸附性 、不能在強堿性環(huán)境中使用 剛性親水性填料，具有一定直徑的多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的球狀顆粒 （三）基本操作 凝膠的選擇 凝膠柱的制備 上樣 洗脫 凝膠柱的重復(fù)使用與保存 凝膠的選擇 分組分離 根據(jù)樣品中的大分子和小分子 分配系數(shù)上的顯著差異 ，將其分開。 可選用 Sephadex G25和 G50 小肽和低分子量的物質(zhì)（ 10005000）的脫鹽可使用 Sephadex G10， G15及 BioGelp2或 4。 分級分離 將樣品中一些 分子量比較近似 的物質(zhì)進行分離。 選用 分級范圍較窄 的凝膠，且中間值 接近于目的蛋白的分子量 凝膠顆粒大小的選擇 優(yōu)點 缺點 小顆粒 分離效果好 流速慢 分離時間長 大顆粒 流速快 區(qū)帶擴散 洗脫峰平而寬 凝膠柱的制備 用于分組分離 短而粗 L/D值＜ 10 用于分級分離 L/D值比較大 對很難分離的組分一般需要 100cm左右長的層析柱，其直徑在 1～ 5cm范圍內(nèi)，小于 1cm產(chǎn)生 管壁效應(yīng) ，大于 5cm則 稀釋現(xiàn)象 嚴重 。 ?柱 L/D值的選擇 裝柱前，凝膠基質(zhì)用蒸餾水或洗脫液 充分溶脹。 凝膠柱填裝后通?？梢圆捎靡环N 有色的物質(zhì) ，如 藍色葡聚糖 202血紅蛋白 等上柱，以檢測凝膠柱的均勻程度。 上樣 分組分離 加樣體積約為凝膠柱床體積的 10％～ 25％ 分級分離 加樣體積約為凝膠柱床體積的 1％～ 5％ 洗脫 水 分離 不帶電荷 的中性物質(zhì) 電解質(zhì)溶液 （酸、堿、鹽的溶液 ） 分離 帶電基團 的樣品 水與有機溶劑的混合液（ 水 甲醇、水 乙醇、 水 丙酮） 用于 吸附較強 的組分 ?洗脫液 凝膠柱的重復(fù)使用與保存 當樣品的各組分全部洗脫下來之后，即可以加入新的樣品，繼續(xù)使用。 保存 ? 液相中保存：于凝膠懸液中加入 防腐劑 或 高壓滅菌 后 4℃ 保存。 ? 在半收縮狀態(tài)下保存： 60%70%酒精 液洗沖，凝膠 體積縮小后冷藏或常溫保存。 ? 干燥狀態(tài)保存：長期不用，水洗凈后，用含乙醇的水洗，逐漸加大乙醇用量，最后用 95%的乙醇 洗，干燥后常溫保存。 （四）凝膠層析的應(yīng)用 脫鹽 分離提純 測定高分子物質(zhì)的分子量 高分子溶液的濃縮 蛋白質(zhì)復(fù)性研究 脫鹽 將高分子溶液中的低分子量雜質(zhì)除去，這一操作稱為脫鹽?？梢杂媚z層析法。 優(yōu)點： 操作簡便、快速、蛋白質(zhì)和酶類等不易變性 適用的凝膠： SephadexG 1 25或 BioGelp 6