【正文】 hromatography) 凝膠層析又稱分子篩過濾、排阻層析等，依據(jù)是 多孔的載體對不同體積和不同形狀分子的排阻能力的不同 ， 從而對混合物進(jìn)行分離。 緩沖液不能干擾洗脫液的測定。 惰性支持物 (高分子聚合物基質(zhì) ) 解離基團(tuán) (配基 ) 共價結(jié)合 ?平衡離子是結(jié)合于配基上的相反離子，它能與溶液中其它的離子基團(tuán)發(fā)生可逆的交換反應(yīng)。 第四節(jié) 蛋白質(zhì)的層析分離 層析技術(shù)也稱色譜法 (chromatography)，是 1906年俄國植物學(xué)家 Michael Tswett發(fā)現(xiàn)并命名的。 三、抽提 抽提過程中需要注意： ? ⑦ 防止 植物組織中的 多酚物質(zhì)，氧化褐變 ，干擾蛋白質(zhì)的分離提純。 一、材料的選擇 材料中蛋白質(zhì)含量的多少與下列因素有關(guān)： ? 種屬差異 ，如人與牛的同一種蛋白質(zhì)，其含量常常相差十倍之多； ? 個體差異 ，在不同個體中，蛋白質(zhì)含量也有明顯的不同； ? 由于 性別、年齡、季節(jié)、飼料條件 的不同，蛋白質(zhì)的含量也會發(fā)生變化。 ? 此二法只能處理少量樣品，所以在提純的后期使用，比較合適。 ? 一般蛋白質(zhì)，酶、抗體、激素蛋白、毒素蛋白等 ? 存在部位 – 器官、組織、體液 – 胞內(nèi)、胞外 一、蛋白質(zhì)的存在 ? 存在形式 – 游離狀態(tài) 消化液中的蛋白 – 結(jié)合狀態(tài) 蛋白與蛋白 蛋白與非蛋白 二、為什么要分離提純蛋白質(zhì) ? ? 農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的需要 – (1)對農(nóng)副產(chǎn)品的綜合利用需要高活性的酶制劑。所以，結(jié)晶法是在提純的后期使用的。 ? 植物細(xì)胞，韋林氏搗切器、壓榨機(jī)、石英砂研磨。 ? ⑩ 可用高速離心法和過濾法 (添加適當(dāng)?shù)闹鸀V劑 )使粗提液澄清。 1941年，英國生物學(xué)家 Martin和 Synge首先提出了色譜塔板理論。 ?回收率高 缺點(diǎn)： ?交換劑膨脹 交聯(lián)葡聚糖 類 型 性 能 離子基因 反離子 總交換容量 （毫克當(dāng)量 /g） DEAEsephadexA25 弱堿性、陰離子交換劑 DEAE+ Cl— 177。因?yàn)楫?dāng)柱上洗脫液的離子強(qiáng)度高到足以完全取代被吸附的離子時，這些 被置換的離子則以同洗脫液等速率從柱上向下移動 ，如果 柱細(xì)長 ，即從脫附到流出之間的距離長，使脫附的離子擴(kuò)散的機(jī)會增加，結(jié)果造成分離峰過寬，降低分辨率。 Kd＝ (VeVo)／ Vi ?Ve 洗脫體積 ?Vo 外水體積 ?Vi 內(nèi)水體積 Ve=Vo 該成分的分子全部被排阻在凝膠顆粒的間隙中，因而 洗脫速度最快 。 2030 5000400000 1000150000 72 5 1472(15) Sephadex G200 中粗 超細(xì) 40120 1040 20177。 （四）凝膠層析的應(yīng)用 脫鹽 分離提純 測定高分子物質(zhì)的分子量 高分子溶液的濃縮 蛋白質(zhì)復(fù)性研究 脫鹽 將高分子溶液中的低分子量雜質(zhì)除去，這一操作稱為脫鹽。 分離原理 通過將具有親和力的兩個分子中一個固定在不溶性基質(zhì)上，利用分子間親和力的特異性和可逆性，對另一個分子進(jìn)行分離純化。 ?應(yīng)具有壓力平穩(wěn)、脈沖小、流量穩(wěn)定可調(diào)、耐腐蝕等特性 (2)梯度淋洗裝置 ?外梯度 : ?利用兩臺高壓輸液泵，將兩種不同極性的溶劑按一定的比例送入梯度混合室，混合后進(jìn)入色譜柱。 由于多孔層厚度薄 ， 最大允許量受到限制 。對流動相溶劑的要求是： （ 1）溶劑對于待測樣品，必須具有合適的極性和良好的選擇性。 ② 醋酸纖維素薄膜電泳：醫(yī)學(xué)上，常用于分析血清蛋白、胎盤球蛋白，其優(yōu)點(diǎn)是簡便迅速，便于保存照相，比紙電泳分辨率高。 2） 光聚合 光聚合通常用核黃素為催化劑，核黃素經(jīng)光照形成無色基，再被痕量氧氧化形成自由基，引發(fā)聚合反應(yīng)。 3. 不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠電泳 系統(tǒng)的不連續(xù)性表現(xiàn)在以下幾個方面： 1） 凝膠由上、下兩層凝膠組成，兩層凝膠的孔徑不同，上層為大孔徑的濃縮膠（ 2~3％），下層為小孔徑的分離膠（ 5~15％ ）。 當(dāng)凝膠濃度確定后，交聯(lián)度為 5%時，凝膠具有最小孔徑， 超過 5%或低于 5%時凝膠孔徑都要增大。 ?聚丙烯酰胺凝膠是由丙烯酰胺單體（ acrylamide，簡稱Acr）和交聯(lián)劑 N， N’甲叉雙丙烯酰胺（ methylane bisacrylamide，簡稱 Bis）在催化劑作用下合成的。 區(qū)帶電泳： 是指有支持介質(zhì)的電泳，待分離物質(zhì)在支持介質(zhì)上分離成若干區(qū)帶。 采用正相液 液分配分離時：首先選擇中等極性溶劑，若組分的保留時間太短，降低溶劑極性，反之增加?？沙惺軌毫ι舷逓??108Pa。 目前已知的有機(jī)化合物中，可用氣相色譜分析的約占20%，而 80%則需用高效液相色譜來分析。 蛋白質(zhì)的洗脫 低濃度的 水溶性乙醇 、 去污劑 和具有 鹽溶作用的鹽 破壞水的結(jié)構(gòu)、降低表面張力，從而削弱疏水相互作用。 上樣 分組分離 加樣體積約為凝膠柱床體積的 10％～ 25％ 分級分離 加樣體積約為凝膠柱床體積的 1％～ 5％ 洗脫 水 分離 不帶電荷 的中性物質(zhì) 電解質(zhì)溶液 （酸、堿、鹽的溶液 ） 分離 帶電基團(tuán) 的樣品 水與有機(jī)溶劑的混合液（ 水 甲醇、水 乙醇、 水 丙酮） 用于 吸附較強(qiáng) 的組分 ?洗脫液 凝膠柱的重復(fù)使用與保存 當(dāng)樣品的各組分全部洗脫下來之后，即可以加入新的樣品，繼續(xù)使用。 46 10005000 1005000 6 2 9810(100) Sephadex G50 粗 中粗 細(xì) 超細(xì) 100300 50150 2080 1040 177。 C下 保存。 ?水懸浮 去除雜質(zhì)和細(xì)小顆粒 緩沖液的選擇 離子強(qiáng)度和 pH 保證各個待分離物質(zhì)的穩(wěn)定；使待分離樣品與離子交換劑有較穩(wěn)定的結(jié)合，而盡量使雜質(zhì)不與離子交換劑結(jié)合或結(jié)合不穩(wěn)定； 注意 平衡緩沖液中不能有與離子交換劑結(jié)合力強(qiáng)的離子，否則會大大降低交換容量，影響分離效果。 原理：利用 蛋白質(zhì)的電荷 和 層析載體的電荷 間的相互作用 ， 進(jìn)而達(dá)到分離純化的目的 。若它在具有密度梯度的介質(zhì)中離心時，質(zhì)量和密度大的顆粒沉降的較快，每種蛋白質(zhì)顆粒沉降到與自身密度相等的介質(zhì)密度時，即停止不前。 ? ③抽提含有活性巰基的蛋白質(zhì)時，要 保護(hù)巰基 – 不要帶入金屬離子，可加入金屬螯合劑，如 EDTA； – 不要帶進(jìn)氧化劑，可加入還原劑，如抗壞血酸等； 三、抽提 抽提過程中需要注意： ? ④抽提帶非共價鍵結(jié)合的配基的蛋白質(zhì)時，要 保護(hù)配基 ，不要使其丟失； ? ⑤選擇抽提條件時應(yīng)考慮，盡量 減少 非蛋白質(zhì) 雜質(zhì) 被同時抽提出來； ? ⑥如實(shí)驗(yàn)材料含有大量的脂肪，為了避免它干擾以后的分離提純操作，須用有機(jī)溶劑 (如：丙酮、石油醚 )萃取，以 去除脂肪 。 四、蛋白質(zhì)分離提純的一般程序 需要額外注意的兩個問題： ? 天然構(gòu)象的保持 ? 多亞基多功能寡聚酶 第二節(jié) 前處理 一、材料的選擇 二、細(xì)胞破碎 三、抽提 第二節(jié) 前處理 一、材料的選擇 ? 選材的原則是： – (1)材料中所需蛋白質(zhì)的含量要高； – (2)材料易得。 ? 柱層析法對蛋白質(zhì)的分離提純效果很好，但不能處理大量的樣品溶液 – 制備性聚丙烯酰胺 凝膠電泳 ，或 蔗糖密度梯度等電聚焦法 進(jìn)一步提純。 – (2)用酶分析法測定家畜家禽以及農(nóng)作物中某種物質(zhì)的含量，需要用高純度的酶制劑。 四、蛋白質(zhì)分離提純的一般程序 ? 第四階段 (質(zhì)量鑒定 )：純度、濃度 – SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳法、等電聚焦法、超離心沉降法、免疫電泳法、酶活力法、蛋白質(zhì)化學(xué)結(jié)構(gòu)分析法等。 ? 酵母和細(xì)菌細(xì)胞，可用法蘭西壓榨機(jī)(Frenchpress)、 Manton— Gaulin勻漿器、振動研磨機(jī)、超聲波破碎、反復(fù)凍融法。粗提液中如有大量核酸，可用核酸酶或用魚精蛋白去除。 以后層析法不斷發(fā)展，相繼出現(xiàn)氣相層析、高壓液相層析、紙層析、薄層層析、親和層析、凝膠層析等。 DEAEsephadexA50 QAEsephadexA25 弱堿性、陰離子交換劑 QAE+ Cl— 177。用交聯(lián)葡聚糖離子交換劑和纖維素離子交換劑時，常用的柱高為 15～ 20cm。即該成分的 Kd＝ 0。 3040 5000800000 1000202200 72 5 981(10) 瓊脂糖系列 較常用的是 Pharmacia和 BioRad兩家的產(chǎn)品，前者生產(chǎn)的稱為 Sepharose，后者的產(chǎn)品為 BioGel A?？梢杂媚z層析法。 優(yōu)點(diǎn) ? 提純效率高 ? 分離快速 （二）親和層析用基質(zhì) 具有 較好 的物理化學(xué) 穩(wěn)定性 能夠和 配體穩(wěn)定的結(jié)合 結(jié)構(gòu)為 均勻 的 多孔網(wǎng)狀 結(jié)構(gòu) 與樣品中的各個組分均 沒有明顯的非特異性吸附 各類基質(zhì)優(yōu)缺點(diǎn) 優(yōu)點(diǎn) 缺點(diǎn) 纖維素 價格低、活性基團(tuán)較多 非特異性吸附強(qiáng)、穩(wěn)定性和均一性較差 交聯(lián)葡聚糖 穩(wěn)定性較好 孔徑較小、穩(wěn)定性不好 聚丙烯酰胺 同上 同上 瓊脂糖 非特異性吸附低、穩(wěn)定性好、孔徑均勻適當(dāng)、宜于活化 多孔玻璃 機(jī)械強(qiáng)度好，化學(xué)穩(wěn)定性好 活性基團(tuán)較少、對蛋白質(zhì)有較強(qiáng)的吸附作用 基質(zhì)的活化 溴化氰活化 環(huán)氧乙烷基活化 指通過對基質(zhì)進(jìn)行一定的化學(xué)處理，使基質(zhì)表面上的一些 化學(xué)基團(tuán) 轉(zhuǎn)變?yōu)?易于和特定配體結(jié)合 的活性基團(tuán) 。 ?內(nèi)梯度 : ?一臺高壓泵 , 通過比例調(diào)節(jié)閥 ,將兩種或多種不同極性的溶劑按一定的比例抽入高壓泵中混合。 2. 全多孔型固定相 由直徑為 10nm的硅膠微粒凝聚而成 。 （ 2）溶劑與檢測器匹配。 ?以上二種類型的電泳，由于介質(zhì)的孔徑度大，沒有分子篩效應(yīng)，主要靠被分離物的電荷多少進(jìn)行分離。 TEMED的存在，可以加速聚合。 2） 緩沖液離子組成的不連續(xù)性。濃度過小，凝膠稀軟，不易操作，也易斷裂。聚丙烯酰胺凝膠具有機(jī)械強(qiáng)度好，有彈性，透明，化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，對 pH和溫度變化小，沒有吸附和電滲作用小的特點(diǎn)，是一種很好的電泳支持介質(zhì)。其裝置復(fù)雜，價格昂貴，費(fèi)時費(fèi)力，不便于推廣應(yīng)用。 3. 流動相選擇 在選擇溶劑時，溶劑的極性是選擇的重要依據(jù)。 硬膠 主要用于離子交換和尺寸排阻色譜中，它由聚苯乙烯與二乙烯苯基交聯(lián)而成。 高效液相色譜對樣品的適用性廣，不受分析對象揮發(fā)性和熱穩(wěn)定性的限制，因而彌補(bǔ)了氣相色譜法的不足。 ?最常用的鹽： (NH4)2SO4 、 Na2SO4 和 NaCl 緩沖液的選擇 隨著 pH的升高，疏水作用相應(yīng)下降 由于 pH升高時，帶點(diǎn)基團(tuán)增加，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)的親水性增加 在中性 pH條件下與疏水相互作用介質(zhì)不結(jié)合的蛋白質(zhì)，在酸性 pH條件下則能夠結(jié)合 ﹡ 洗脫時，洗脫液 pH逐漸升高。 凝膠柱填裝后通?？梢圆捎靡环N 有色的物質(zhì) ，如 藍(lán)色葡聚糖 202血紅蛋白 等上柱，以檢測凝膠柱的均勻程度。 1500 1500 3 1 9810(100) Sephadex G25 粗 中粗 細(xì) 超細(xì) 100300 50150 2080 1040 177。 保存 處理洗凈蛋白等雜質(zhì)后，加入適當(dāng)?shù)姆栏瘎?，一般加? %的疊氮鈉， 4176。 ? 膨化 將干粉在水中充分溶脹，以使離子交換劑顆粒的孔隙增大，具有交換活性的配基充分暴露出來。紙層析 照相保存 掃描儀轉(zhuǎn)為圖形 積分儀變成數(shù)據(jù) 柱層析 檢測器、記錄儀和積分儀處理 層析裝置的儀器化 HPLC ?與微機(jī)、質(zhì)譜等連用 二、離子交換層析 (ion exchange chromatography， IEX) （一）原理 離子交換層析 (ion exchange chromatography， IEX) 技術(shù) 是以離子交換纖維素或以離子交換葡聚糖凝膠為固定相 ， 以蛋白質(zhì)等樣品為移動相 ， 分離和提純蛋白質(zhì) 、 核酸