【正文】 的各個組分均 沒有明顯的非特異性吸附 各類基質(zhì)優(yōu)缺點 優(yōu)點 缺點 纖維素 價格低、活性基團較多 非特異性吸附強、穩(wěn)定性和均一性較差 交聯(lián)葡聚糖 穩(wěn)定性較好 孔徑較小、穩(wěn)定性不好 聚丙烯酰胺 同上 同上 瓊脂糖 非特異性吸附低、穩(wěn)定性好、孔徑均勻適當(dāng)、宜于活化 多孔玻璃 機械強度好，化學(xué)穩(wěn)定性好 活性基團較少、對蛋白質(zhì)有較強的吸附作用 基質(zhì)的活化 溴化氰活化 環(huán)氧乙烷基活化 指通過對基質(zhì)進行一定的化學(xué)處理，使基質(zhì)表面上的一些 化學(xué)基團 轉(zhuǎn)變?yōu)?易于和特定配體結(jié)合 的活性基團 。 可避免蛋白質(zhì)變性 缺點： 較長的時間、較大的洗脫條件。 無化學(xué)鍵引入，只存在相對較弱的 氫鍵 、 范德華力 和疏水作用力 相互作用。 特點： 高壓、高效、高速，高沸點、熱不穩(wěn)定有機及生化試樣的高效分離分析方法。 ?內(nèi)梯度 : ?一臺高壓泵 , 通過比例調(diào)節(jié)閥 ,將兩種或多種不同極性的溶劑按一定的比例抽入高壓泵中混合。 c. 示差折光檢測器 （ differential refractive index detector） 除紫外檢測器之外應(yīng)用最多的檢測器； 可連續(xù)檢測參比池和樣品池中流動相之間的折光指數(shù)差值 。 剛性固體 以二氧化硅為基質(zhì)，可承受?108 ～ ?109Pa的高壓，可制成直徑、形狀、孔隙度不同的顆粒。 固定相按孔隙深度分類，可分為表面多孔型和全多孔型固定相兩類。 2. 全多孔型固定相 由直徑為 10nm的硅膠微粒凝聚而成 。 流動相組成改變 ， 極性改變 ， 可顯著改變組分分離狀況； （ 2） 親水性固定液常采用疏水性流動相 ， 即流動相的極性小于固定相的極性 ， 稱為正相液液色譜法 ， 極性柱也稱正相柱 。 常用溶劑： 己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇 乙腈、水、緩沖液。 也可在低極性溶劑中，逐漸增加其中的極性溶劑，使保留時間縮短。 （ 2）溶劑與檢測器匹配。 （ 4）化學(xué)穩(wěn)定性好 （ 5） 低粘度（粘度適中） 若使用高粘度溶劑，勢必增高壓力，不利于分離。但電泳技術(shù)的廣泛應(yīng)用，則是在 1937年用濾紙作為支持介質(zhì)成功地進行紙電泳以后，特別是近幾十年以來，電泳技術(shù)發(fā)展很快，各種類型的電泳技術(shù)相繼誕生，在生物化學(xué)、醫(yī)學(xué)、免疫學(xué)等領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用。支持介質(zhì)的作用主要是防止電泳過程中的對流和擴散，以使被分離的成分得到最大分辨率的分離。 ?以上二種類型的電泳，由于介質(zhì)的孔徑度大，沒有分子篩效應(yīng)，主要靠被分離物的電荷多少進行分離。瓊脂糖凝膠孔徑度較大，對大部分蛋白質(zhì)只有很小的分子篩效應(yīng)。 電泳受 粒子本身大小、形狀、所帶電量 、溶液粘度、溫度、 pH、電滲及離子強度 多種因素的影響。 CH2=CH C=O NH2 丙烯酰胺 N, N’甲叉 雙丙烯酰胺 CH2=CH C=O NH CH2 NH C=O CH2=CH 聚丙烯酰胺 CH2CH C=O NH2 CH2CH C=O NH CH2 NH C=O CH2CH CH2175。 TEMED的存在，可以加速聚合。 （ 2） 低溫、低 pH都會減慢聚合反應(yīng)速度。 凝膠濃度越大，孔徑越小 。 在濃度為 % 的凝膠中，大多數(shù)生物體內(nèi)的蛋白質(zhì)能得到滿意的分離效果。 2） 緩沖液離子組成的不連續(xù)性。 4） 在電場中形成不連續(xù)的電位梯度。 3） 凝膠的 pH不同。 對于一個未知樣品，常用 %的標(biāo)準(zhǔn)膠或 4%10% 的凝膠梯度來測試，而后選出適宜的凝膠濃度。濃度過小，凝膠稀軟，不易操作，也易斷裂。 2. 凝膠濃度和交聯(lián)度與孔徑大小的關(guān)系 凝膠的物理性質(zhì)如機械強度、彈性、透明度和粘著度都取決于凝膠總濃度（ T）和 Acr與 Bis兩者之比。在進行化學(xué)聚合前，一般用減壓抽氣的辦法除去溶液中溶解的空氣。微量 TEMED的加入，可促使過硫酸銨形成自由基： S2O82 2?SO4 這些自由基的產(chǎn)生可引發(fā)丙烯酰胺與甲叉雙丙烯酰胺的聚合、交聯(lián)反應(yīng)，形成有一定平均孔徑的聚丙烯酰胺。聚丙烯酰胺凝膠具有機械強度好，有彈性，透明，化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，對 pH和溫度變化小，沒有吸附和電滲作用小的特點，是一種很好的電泳支持介質(zhì)。其分辨率較高。天然淀粉經(jīng)加工處理即可使用，但孔徑度可調(diào)性差，并且由于其批號之間的質(zhì)量相差很大，很難得到重復(fù)的電泳結(jié)果，加之電泳時間長，操作麻煩，分辨率低，實驗室中已很少使用。 一、概述 （二）分類 按支持介質(zhì)種類的不同，區(qū)帶電泳可分為： ① 紙電泳：用濾紙作為支持介質(zhì)，多用于核苷酸的定性定量分析。其裝置復(fù)雜，價格昂貴，費時費力，不便于推廣應(yīng)用。 第五節(jié) 蛋白質(zhì)的電泳分離 一、概述 二、 PAGE凝膠電泳 三、 SDSPAGE凝膠電泳 四、聚丙烯酰胺凝膠等電聚焦電泳 五、雙向電泳 六、毛細管電泳 電泳的概念 ： 帶電物質(zhì)在電場中向相反電極移動的現(xiàn)象稱為電泳（ electrophoresis）。 （ 3）高純度 由于高效液相色譜靈敏度高，對流動相溶劑的純度也要求高。 由于高效液相色譜中流動相是液體，它對組分有親合力，并參與固定相對組分的競爭，因此，正確選擇流動相直接影響組分的分離度。 3. 流動相選擇 在選擇溶劑時，溶劑的極性是選擇的重要依據(jù)。 組分在兩種類型分離柱上的出峰順序相反 。 特別適合復(fù)雜混合物分離及衡量分析 。 這類固定相的多孔層厚度小 、 孔淺 ， 相對死體積小 ， 出峰迅速 、 柱效亦高；顆粒較大 ， 滲透性好 ， 裝柱容易 ， 梯度淋洗時能迅速達到平衡 ， 較適合做常規(guī)分析 。 硬膠 主要用于離子交換和尺寸排阻色譜中，它由聚苯乙烯與二乙烯苯基交聯(lián)而成。發(fā)展趨勢是減小填料粒度和柱徑以提高柱效。 ? 特點： ? 靈敏度高； ? 線形范圍高； ? 流通池可做的很小 （ 1mm 10mm ，容積 8μL） ； ? 對流動相的流速和溫度變化不敏感； ? 波長可選，易于操作； ? 可用于梯度洗脫。 ?為了獲得高柱效而使用粒度很小的固定相（ 10μm），液體的流動相高速通過時，將產(chǎn)生很高的壓力，因此高壓、高速是高效液相色譜的特點之一。 高效液相色譜對樣品的適用性廣，不受分析對象揮發(fā)性和熱穩(wěn)定性的限制，因而彌補了氣相色譜法的不足。 配體結(jié)合較強時 適當(dāng)?shù)?pH、離子強度洗脫 ，注意盡量不影響待分離物質(zhì)的活性 與配體結(jié)合非常牢固時 使用較強的 酸、堿 或在洗脫液中加入 脲、胍等變性劑 ，使蛋白質(zhì)等待分離物質(zhì)變性，洗脫后再復(fù)性 吸附劑的再生和保存 再生 用 大量 的洗脫液或 較高濃度 的鹽溶液洗滌，再用平衡液重新平衡 嚴(yán)重的不可逆吸附時，使用 高濃度的鹽溶液、尿素等變性劑 或加入適當(dāng)?shù)?非專一性蛋白酶 保存 加入 %的疊氮化鈉， 4176。 非特異性洗脫 指通過改變洗脫緩沖液 pH、離子強度、溫度等條件，降低待分離物質(zhì)與配體的親和力而將待分離物質(zhì)洗脫下來。 親和力 生物分子間存在很多特異性的相互作用，如抗原 抗體、酶 底物或抑制劑、激素 受體等，它們之間都能夠 專一而可逆 的結(jié)合。 ?最常用的鹽： (NH4)2SO4 、 Na2SO4 和 NaCl 緩沖液的選擇 隨著 pH的升高，疏水作用相應(yīng)下降 由于 pH升高時，帶點基團增加，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)的親水性增加 在中性 pH條件下與疏水相互作用介質(zhì)不結(jié)合的蛋白質(zhì)，在酸性 pH條件下則能夠結(jié)合 ﹡ 洗脫時，洗脫液 pH逐漸升高。 影響疏水作用的因素： 蛋白質(zhì)的疏水性、蛋白質(zhì)的環(huán)境 Water molecules Solute Surface exposed hydrophobic groups Ligand Water molecules in bulk （二）疏水基質(zhì) 人工合成聚合物類 瓊脂糖 纖維素 聚苯乙烯 聚丙烯酸甲酯類 多糖類 殼聚糖 應(yīng)用最廣泛 良好的生物相容性和化學(xué)穩(wěn)定性 （三）疏水配基 烷基鏈配基 芳基配基 高分子配基 柱： HiPrep 16/10 樣品 : 細胞色素 C(1)，溶菌酶（ 2），核糖核酸酶（ 3）， 靡蛋白酶原（ 4） （四）基本操作 ?平衡 Equilibration ?上樣 Sample application ?洗雜 Washing ?洗脫 Elution Equilibration 1. Equilibration 2. Sample application 3. Washing 4. Elution Water molecules Hydrophobic ligand Gel matrix Sample application 1. Equilibration 2. Sample application 3. Washing 4. Elution Gel matrix Proteins Hydrophobic groups Washing out unbound material 1. Equilibration 2. Sample application 3. Washing 4. Elution Conc. salt Abs Nonbound proteins 1. Equilibration 2. Sample application 3. Washing 4. Elution Elution Target elutes Conc. salt Abs Elution 1. Equilibration 2. Sample application 3. Washing 4. Elution Conc. salt Abs More strongly bound proteins 層析柱的選擇 柱床高度通常為 5～ 15cm 對一個優(yōu)化好的分離方案進行 規(guī)模放大 時，可保持柱高不變， 增加柱的直徑 粗柱子（內(nèi)徑為 ～ ）適合進行 HIC層析。每種規(guī)格都有其特定的分級的范圍， 一旦超出分組范圍 ，不論是其上限還是下限，即使分子量有大有小，但載體的排阻情況基本相同 ，就 不能分離 。 ? 干燥狀態(tài)保存：長期不用，水洗凈后，用含乙醇的水洗，逐漸加大乙醇用量，最后用 95%的乙醇 洗，干燥后常溫保存。 凝膠柱填裝后通?？梢圆捎靡环N 有色的物質(zhì) ，如 藍色葡聚糖 202血紅蛋白 等上柱，以檢測凝膠柱的均勻程度。 可選用 Sephadex G25和 G50 小肽和低分子量的物質(zhì)（ 10005000）的脫鹽可使用 Sephadex G10， G15及 BioGelp2或 4。 聚丙烯酰胺系列 由丙烯酰胺單體和雙丙烯酰胺混合物聚合得到的多孔性物質(zhì)。 1520 4000150000 1000100000 48 5 3434(35) Sephadex G150 中粗 超細 40120 1040 15177。 1500 1500 3 1 9810(100) Sephadex G25 粗 中粗 細 超細 100300 50150 2080 1040 177。 ?凝膠 交聯(lián)度 ?凝膠 顆粒大小 流速 過低 樣品橫向擴散增大， 峰變寬 ，分辨率降低，洗脫時間長 流速 過高 洗脫 峰重疊 ，柱壓增大，分離效果變差 線性流速控制在 2～ 10cm/h ② 加樣體積 體積 過大 平臺洗脫峰或相鄰 峰重疊 體積過小 目的蛋白 收集量少 、稀釋倍數(shù)大、 濃度低 ③ 樣品濃度 進