【正文】 電極緩沖液為 Tris甘氨酸緩沖液，濃縮膠為 TrisHCl緩沖液，而分離膠為 的 TrisHCl緩沖液。 3. 不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠電泳 系統(tǒng)的不連續(xù)性表現(xiàn)在以下幾個(gè)方面： 1） 凝膠由上、下兩層凝膠組成，兩層凝膠的孔徑不同，上層為大孔徑的濃縮膠（ 2~3％），下層為小孔徑的分離膠（ 5~15％ ）。 當(dāng)凝膠濃度確定后，交聯(lián)度為 5%時(shí)，凝膠具有最小孔徑， 超過(guò) 5%或低于 5%時(shí)凝膠孔徑都要增大。凝膠總濃度（ T）和交聯(lián)度（ C）的計(jì)算公式分別為： Acr（ g） +Bis（ g） Bis（ g） X100% C = Acr（ g） +Bis（ g） V（ ml） X100% T = 凝膠孔徑大小，主要受凝膠濃度的影響。在膠液表面，往往覆蓋一層水或溶液，隔絕空氣，可加速聚合。 2） 光聚合 光聚合通常用核黃素為催化劑，核黃素經(jīng)光照形成無(wú)色基，再被痕量氧氧化形成自由基，引發(fā)聚合反應(yīng)。 ?聚丙烯酰胺凝膠是由丙烯酰胺單體（ acrylamide，簡(jiǎn)稱Acr）和交聯(lián)劑 N， N’甲叉雙丙烯酰胺（ methylane bisacrylamide，簡(jiǎn)稱 Bis）在催化劑作用下合成的。 ?聚丙烯酰胺和瓊脂糖是目前實(shí)驗(yàn)室最常用的支持介質(zhì) （三）基本原理 電泳是在電場(chǎng)的作用下而產(chǎn)生的物質(zhì)運(yùn)動(dòng)，不同的物質(zhì)在一定的電場(chǎng)強(qiáng)度下，由于所帶電荷不同，因此受到的引力不同，向相反電極泳動(dòng)速度不同進(jìn)而達(dá)到分離目的。 ④ 瓊脂糖凝膠電泳：一般用于核酸的分離分析。 ② 醋酸纖維素薄膜電泳：醫(yī)學(xué)上，常用于分析血清蛋白、胎盤(pán)球蛋白，其優(yōu)點(diǎn)是簡(jiǎn)便迅速，便于保存照相，比紙電泳分辨率高。 區(qū)帶電泳： 是指有支持介質(zhì)的電泳，待分離物質(zhì)在支持介質(zhì)上分離成若干區(qū)帶。 電泳現(xiàn)象早在十九世紀(jì)初就已發(fā)現(xiàn)（ 1808年俄國(guó)物理學(xué)家 Re?ss進(jìn)行了世界上第一次電泳實(shí)驗(yàn) ）。不純的溶劑會(huì)引起基線不穩(wěn)，或產(chǎn)生“偽峰”。對(duì)流動(dòng)相溶劑的要求是： （ 1）溶劑對(duì)于待測(cè)樣品，必須具有合適的極性和良好的選擇性。 采用正相液 液分配分離時(shí)：首先選擇中等極性溶劑，若組分的保留時(shí)間太短，降低溶劑極性，反之增加。 2. 流動(dòng)相類(lèi)別 按流動(dòng)相組成分：?jiǎn)谓M分和多組分； 按極性分：極性、弱極性、非極性； 按使用方式分：固定組成淋洗和梯度淋洗。 （四）液相色譜的流動(dòng)相 1. 流動(dòng)相特性 （ 1） 液相色譜的流動(dòng)相又稱為：淋洗液 ， 洗脫劑 。 由于多孔層厚度薄 ， 最大允許量受到限制 。可承受壓力上限為 ?108Pa。 （三）高效液相色譜的固定相 高效液相色譜固定相以承受高壓能力來(lái)分類(lèi)，可分為剛性固體和硬膠兩大類(lèi)。 b. 光電二極管陣列檢測(cè)器 紫外檢測(cè)器的重要進(jìn)展； 光電二極管陣列檢測(cè)器： 1024個(gè)二極管陣列 ， 各檢測(cè)特定波長(zhǎng) ， 計(jì)算機(jī)快速處理 ， 三維立體譜圖 ， 如圖所示 。 ?應(yīng)具有壓力平穩(wěn)、脈沖小、流量穩(wěn)定可調(diào)、耐腐蝕等特性 (2)梯度淋洗裝置 ?外梯度 : ?利用兩臺(tái)高壓輸液泵，將兩種不同極性的溶劑按一定的比例送入梯度混合室，混合后進(jìn)入色譜柱。 目前已知的有機(jī)化合物中，可用氣相色譜分析的約占20%，而 80%則需用高效液相色譜來(lái)分析。 C 下保存 五、親和層析用于蛋白質(zhì)分離的實(shí)例 免疫親和層析 凝集素和糖蛋白親和層析 含有輔酶的酶類(lèi)的親和層析 酶和蛋白類(lèi)型抑制劑的親和層析 肝素為配體的親和層析 染料配體親和層析 金屬螯合層析 六、吸附層析 (absorption chromatography) （一）原理 蛋白質(zhì)分子通過(guò)各種次級(jí)鍵的作用能吸附在某些吸附劑上，根據(jù)不同蛋白質(zhì)對(duì)固定相 (吸附劑 ) 的 吸附程度不同 ，以及其在相應(yīng)的流動(dòng)相 (溶劑 )中溶解度的差異來(lái)實(shí)現(xiàn)，經(jīng)反復(fù)的 吸附 — 解吸 — 再吸附 — 再解吸 的過(guò)程，達(dá)到分離目的。 特異性洗脫 優(yōu)點(diǎn)： 特異性強(qiáng)，可以進(jìn)一步消除非特異性吸附的影響，從而得到較高的分辨率。 分離原理 通過(guò)將具有親和力的兩個(gè)分子中一個(gè)固定在不溶性基質(zhì)上，利用分子間親和力的特異性和可逆性，對(duì)另一個(gè)分子進(jìn)行分離純化。 蛋白質(zhì)的洗脫 低濃度的 水溶性乙醇 、 去污劑 和具有 鹽溶作用的鹽 破壞水的結(jié)構(gòu)、降低表面張力，從而削弱疏水相互作用。 緩沖液的選擇 往平衡的緩沖液和樣品中加入一種 鹽析鹽 ，有利于固定化配基與蛋白質(zhì)的相互作用。 在凝膠過(guò)濾層析時(shí)，要根據(jù)所要純化的樣品的分子量選擇所用的凝膠過(guò)濾的基質(zhì) 。 （四）凝膠層析的應(yīng)用 脫鹽 分離提純 測(cè)定高分子物質(zhì)的分子量 高分子溶液的濃縮 蛋白質(zhì)復(fù)性研究 脫鹽 將高分子溶液中的低分子量雜質(zhì)除去，這一操作稱為脫鹽。 上樣 分組分離 加樣體積約為凝膠柱床體積的 10％～ 25％ 分級(jí)分離 加樣體積約為凝膠柱床體積的 1％～ 5％ 洗脫 水 分離 不帶電荷 的中性物質(zhì) 電解質(zhì)溶液 （酸、堿、鹽的溶液 ） 分離 帶電基團(tuán) 的樣品 水與有機(jī)溶劑的混合液（ 水 甲醇、水 乙醇、 水 丙酮） 用于 吸附較強(qiáng) 的組分 ?洗脫液 凝膠柱的重復(fù)使用與保存 當(dāng)樣品的各組分全部洗脫下來(lái)之后，即可以加入新的樣品，繼續(xù)使用。 分級(jí)分離 將樣品中一些 分子量比較近似 的物質(zhì)進(jìn)行分離。 先制成丙烯基的衍生物，然后再用 N， N’甲叉雙丙烯酰胺交聯(lián)，得到商品化的凝膠， 產(chǎn)物也是固體粉末，用前先溶漲。 2030 5000400000 1000150000 72 5 1472(15) Sephadex G200 中粗 超細(xì) 40120 1040 20177。 46 10005000 1005000 6 2 9810(100) Sephadex G50 粗 中粗 細(xì) 超細(xì) 100300 50150 2080 1040 177。脫鹽除雜 適當(dāng)提高樣品濃度 分級(jí)分離 amp。 Kd值介于 0l之間， 物質(zhì)的洗脫速度隨其 Kd值的 增加而降低。 Kd＝ (VeVo)／ Vi ?Ve 洗脫體積 ?Vo 外水體積 ?Vi 內(nèi)水體積 Ve=Vo 該成分的分子全部被排阻在凝膠顆粒的間隙中，因而 洗脫速度最快 。 C下 保存。 → → 清洗 ?金屬污染物 EDTA飽和的 10 mmol/L HCl（即 pH=2）處理柱子 ?沉淀物雜質(zhì) 去污劑、尿素和鹽酸胍，可將柱子在 6 mol/L 的尿素中平衡和溫育，然后用去離子水和緩沖液洗滌。 上樣量要適當(dāng)，不要超過(guò)柱的負(fù)荷能力，通常上樣量為交換劑交換總量的 1％ 5％ 。因?yàn)楫?dāng)柱上洗脫液的離子強(qiáng)度高到足以完全取代被吸附的離子時(shí)，這些 被置換的離子則以同洗脫液等速率從柱上向下移動(dòng) ，如果 柱細(xì)長(zhǎng) ，即從脫附到流出之間的距離長(zhǎng)，使脫附的離子擴(kuò)散的機(jī)會(huì)增加，結(jié)果造成分離峰過(guò)寬，降低分辨率。 ?水懸浮 去除雜質(zhì)和細(xì)小顆粒 緩沖液的選擇 離子強(qiáng)度和 pH 保證各個(gè)待分離物質(zhì)的穩(wěn)定；使待分離樣品與離子交換劑有較穩(wěn)定的結(jié)合，而盡量使雜質(zhì)不與離子交換劑結(jié)合或結(jié)合不穩(wěn)定； 注意 平衡緩沖液中不能有與離子交換劑結(jié)合力強(qiáng)的離子，否則會(huì)大大降低交換容量，影響分離效果。 CMToyopearl 富羥基 高親水性 兼性離子交換劑 基質(zhì)上連有 β丙氨酸 、 對(duì)氨基苯磺酸 、 精氨酸 等偶極離子 （三）基本操作 緩沖液的選擇 層析柱的選擇 洗脫流速 ↓ 加樣 洗脫 洗脫液的監(jiān)測(cè)收集及組分鑒定 離子交換劑的清洗、再生和保存 ↓ ↓ ↓ ← 離子交換劑的處理 ↑ 離子交換劑的選擇 離子交換劑的選擇 配基的選擇 取決于被分離的物質(zhì)在其穩(wěn)定的 pH下所帶的電荷，如果帶正電，則選擇陽(yáng)離子交換劑；如帶負(fù)電，則選擇陰離子交換劑。 SP sephadex C50 優(yōu)點(diǎn)： ?不會(huì)引起被分離物質(zhì)的變性或失活 ?非特異性吸附 ?交換容量大 ?同時(shí)具有分子篩效應(yīng) 離子交換葡聚糖的選用： 一般根據(jù)蛋白質(zhì)的分子量而定 ?中等分子量（ 30000202200）一般選 A50和 C50 ?低分子量（＜ 30000）和高分子量（＞ 202200） 均宜 選用 A25和 C25。 ?回收率高 缺點(diǎn)： ?交換劑膨脹 交聯(lián)葡聚糖 類(lèi) 型 性 能 離子基因 反離子 總交換容量 （毫克當(dāng)量 /g） DEAEsephadexA25 弱堿性、陰離子交換劑 DEAE+ Cl— 177。 原理：利用 蛋白質(zhì)的電荷 和 層析載體的電荷 間的相互作用 ， 進(jìn)而達(dá)到分離純化的目的 。 遞減 遞增 pH 陰離子交換樹(shù)脂 陽(yáng)離子交換樹(shù)脂 離子強(qiáng)度 疏水層析 離子交換層析 改變?nèi)軇┫到y(tǒng) ? 梯度洗脫 一種溶液以 恒定的速度 連續(xù)地進(jìn)入處于溫和攪拌的盛有另一種溶液的容器中，經(jīng) 混合后的液體以同速度沉入層析柱 作為洗脫液，在這樣所得到的洗脫液中一種溶液的濃度以 線性梯度方式 連續(xù)地發(fā)生改變。 （二）層析的分類(lèi) 按 固定相 基質(zhì)的形式： 柱層析、紙層析和薄層層析 根據(jù)流動(dòng)相的形式： 液相層析、氣相層析 凝膠過(guò)濾 原理 吸附層析 疏水層析 分配層析 親和層析 離子交換 （三）層析前蛋白質(zhì)處理 主要是利用 鹽析法、等電點(diǎn)沉淀、有機(jī)溶劑沉淀 等方法，使目的蛋白與其它較大量的雜蛋白分開(kāi)，這些方法的特點(diǎn)是簡(jiǎn)便、處理量大、既能除去大量雜質(zhì)，又能濃縮蛋白質(zhì)，但分辨率低。 1941年，英國(guó)生物學(xué)家 Martin和 Synge首先提出了色譜塔板理論。若它在具有密度梯度的介質(zhì)中離心時(shí)，質(zhì)量和密度大的顆粒沉降的較快，每種蛋白質(zhì)顆粒沉降到與自身密度相等的介質(zhì)密度時(shí)，即停止不前。蛋白質(zhì)被 丙酮沉淀后，應(yīng)立即分離，防止變性。 一、根據(jù)蛋白質(zhì)溶解性的差異分離 2. 有機(jī)溶劑分級(jí)分離法 選擇原則： 與水完全混溶 不與蛋白質(zhì)反應(yīng) 有較好的沉淀效應(yīng) 溶劑蒸氣無(wú)毒、不易燃 原理 ： 是將有機(jī)溶劑（丙酮、乙醇 )加入蛋白質(zhì)溶液中，導(dǎo)致溶液介電常數(shù)降低，增加了相反電荷之間的吸引力，蛋白質(zhì)分子表面可解離基的離子化強(qiáng)度減弱，水化程度降低，因此促進(jìn)了蛋白質(zhì)分子的聚集和沉淀。 ? ⑩ 可用高速離心法和過(guò)濾法 (添加適當(dāng)?shù)闹鸀V劑 )使粗提液澄清。 ? ③抽提含有活性巰基的蛋白質(zhì)時(shí)，要 保護(hù)巰基 – 不要帶入金屬離子，可加入金屬螯合劑，如 EDTA； – 不要帶進(jìn)氧化劑，可加入還原劑，如抗壞血酸等； 三、抽提 抽提過(guò)程中需要注意： ? ④抽提帶非共價(jià)鍵結(jié)合的配基的蛋白質(zhì)時(shí)，要 保護(hù)配基 ，不要使其丟失； ? ⑤選擇抽提條件時(shí)應(yīng)考慮，盡量 減少 非蛋白質(zhì) 雜質(zhì) 被同時(shí)抽提出來(lái)； ? ⑥如實(shí)驗(yàn)材料含有大量的脂肪，為了避免它干擾以后的分離提純操作，須用有機(jī)溶劑 (如：丙酮、石油醚 )萃取，以 去除脂肪 。 ? 不溶性蛋白 ，如角蛋白、膠原、絲心蛋白，可以用適當(dāng)?shù)娜軇┫慈タ扇芪铩Ｃ恳粚拥南鄬?duì)含量即表示細(xì)胞破碎程度。 ? 植物細(xì)胞，韋林氏搗切器、壓榨機(jī)、石英砂研磨。 四、蛋白質(zhì)分離提純的一般程序 需要額外注意的兩個(gè)問(wèn)題： ? 天然構(gòu)象的保持 ? 多亞基多功能寡聚酶 第二節(jié) 前處理 一、材料的選擇 二、細(xì)胞破碎 三、抽提 第二節(jié) 前處理 一、材料的選擇 ? 選材的原則是： – (1)材料中所需蛋白質(zhì)的含量要高； – (2)材料易得。 四、蛋白質(zhì)分離提純的一般程序 防止蛋白質(zhì)變性的措施： ? 防止蛋白質(zhì)自發(fā)變性，可以采取下列措施： – (1)加入低分子量物質(zhì) (如蔗糖和甘