【正文】 油等 )或加入純化的蛋白質(zhì) (如牛血清白蛋白、明膠等 )，以提高蛋白質(zhì)濃度，減少水的傷害。 – 酶需要測(cè)定比活力及酶溶液的蛋白質(zhì)濃度。所以，結(jié)晶法是在提純的后期使用的。 ? 柱層析法對(duì)蛋白質(zhì)的分離提純效果很好，但不能處理大量的樣品溶液 – 制備性聚丙烯酰胺 凝膠電泳 ，或 蔗糖密度梯度等電聚焦法 進(jìn)一步提純。 – 如：鹽析法、等電點(diǎn)法、有機(jī)溶劑沉淀法、選擇性變性法，以及選擇性沉淀法等。 四、蛋白質(zhì)分離提純的一般程序 準(zhǔn)備工作： ? 選材，處理； ? 建立適當(dāng)?shù)募?xì)胞破碎和蛋白質(zhì)抽提方法； ? 建立一系列的分離提純和濃縮的方法； ? 建立靈敏而方便的分析方法，以估計(jì)每一個(gè)分離提純步驟的提純倍數(shù)和收率； ? 建立鑒定純度的方法 (如： SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳、等電聚焦等 )，以鑒定蛋白質(zhì)制劑的純度 。 ? 一般蛋白質(zhì)，酶、抗體、激素蛋白、毒素蛋白等 ? 存在部位 – 器官、組織、體液 – 胞內(nèi)、胞外 一、蛋白質(zhì)的存在 ? 存在形式 – 游離狀態(tài) 消化液中的蛋白 – 結(jié)合狀態(tài) 蛋白與蛋白 蛋白與非蛋白 二、為什么要分離提純蛋白質(zhì) ? ? 農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的需要 – (1)對(duì)農(nóng)副產(chǎn)品的綜合利用需要高活性的酶制劑。 – (2)用酶分析法測(cè)定家畜家禽以及農(nóng)作物中某種物質(zhì)的含量，需要用高純度的酶制劑。 四、蛋白質(zhì)分離提純的一般程序 蛋白質(zhì)分離提純的四個(gè)階段： ? 第一階段 (前處理 )： – 選材，破碎，抽提，離心分離，得無細(xì)胞抽提液。 – 適合于處理大量的樣品溶液。 ? 此二法只能處理少量樣品，所以在提純的后期使用，比較合適。 四、蛋白質(zhì)分離提純的一般程序 ? 第四階段 (質(zhì)量鑒定 )：純度、濃度 – SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳法、等電聚焦法、超離心沉降法、免疫電泳法、酶活力法、蛋白質(zhì)化學(xué)結(jié)構(gòu)分析法等。 四、蛋白質(zhì)分離提純的一般程序 防止蛋白質(zhì)變性的措施： ? 低溫 (0℃ 一 4℃) 操作，防止熱變性和蛋白水解酶水解。 – (2)少數(shù)蛋白質(zhì)必須在高離子強(qiáng)度的極性介質(zhì)中才能保持活性，可以加 KCI，或 NaCl， (NH4)2SO4。 一、材料的選擇 材料中蛋白質(zhì)含量的多少與下列因素有關(guān)： ? 種屬差異 ，如人與牛的同一種蛋白質(zhì)，其含量常常相差十倍之多； ? 個(gè)體差異 ，在不同個(gè)體中，蛋白質(zhì)含量也有明顯的不同； ? 由于 性別、年齡、季節(jié)、飼料條件 的不同，蛋白質(zhì)的含量也會(huì)發(fā)生變化。 ? 酵母和細(xì)菌細(xì)胞，可用法蘭西壓榨機(jī)(Frenchpress)、 Manton— Gaulin勻漿器、振動(dòng)研磨機(jī)、超聲波破碎、反復(fù)凍融法。 三、抽提 抽提就是將破碎細(xì)胞中的蛋白質(zhì)溶解在適當(dāng)?shù)娜軇┲小? 三、抽提 ? 使用類似于生理?xiàng)l件下的緩沖液 – 20～ 50mmol/L的磷酸緩沖液 (～ ) – () – 含少量緩沖液的 – 必要時(shí)，可加入 EDTA(1～ 5mmol/L)，巰基乙醇(320mmol/L)或蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑等。 三、抽提 抽提過程中需要注意： ? ⑦ 防止 植物組織中的 多酚物質(zhì)，氧化褐變 ，干擾蛋白質(zhì)的分離提純。粗提液中如有大量核酸，可用核酸酶或用魚精蛋白去除。 有機(jī)溶劑 優(yōu)點(diǎn)： 比鹽析法分辨率高，提純效果好，生產(chǎn)中應(yīng)用多。 ? 水溶性中性高聚物 – 聚乙二醇（ PEG） ? 聚丙烯酸 —— 堿性蛋白質(zhì) ? 極端條件 – 熱、 pH、有機(jī)溶劑 – 等電點(diǎn)沉淀 – 氯仿 —— 血紅蛋白 ? 免疫沉淀 – 抗原抗體特異結(jié)合形成不溶性復(fù)合物 透析 (dialysis)： 利用透析袋把大分子蛋白質(zhì)與小分子化合物分開的方法 。 第四節(jié) 蛋白質(zhì)的層析分離 層析技術(shù)也稱色譜法 (chromatography)，是 1906年俄國(guó)植物學(xué)家 Michael Tswett發(fā)現(xiàn)并命名的。 以后層析法不斷發(fā)展，相繼出現(xiàn)氣相層析、高壓液相層析、紙層析、薄層層析、親和層析、凝膠層析等。 （四）層析基本操作過程 裝置選擇 上樣和洗脫 結(jié)果檢測(cè) 上樣均一性 洗脫裝置 目的不同 檢測(cè)方法不同 活性檢測(cè) 基質(zhì)均勻性 柱層析的 L/d比值 柱層析的 L/d比值 洗脫裝置 ? 不改變?nèi)軇w系 依靠液面的水位差產(chǎn)生的 靜壓力 致使洗脫液不斷流經(jīng)層析柱 缺點(diǎn)：隨著溶液的流去，水位差也逐漸減小，流速也在變小。 注意：梯度洗脫呈現(xiàn)一個(gè)峰，但有可能存在兩個(gè)性質(zhì)接近的蛋白質(zhì)。 惰性支持物 (高分子聚合物基質(zhì) ) 解離基團(tuán) (配基 ) 共價(jià)結(jié)合 ?平衡離子是結(jié)合于配基上的相反離子，它能與溶液中其它的離子基團(tuán)發(fā)生可逆的交換反應(yīng)。 DEAEsephadexA50 QAEsephadexA25 弱堿性、陰離子交換劑 QAE+ Cl— 177。 瓊脂糖離子交換劑 交換劑 名 稱 特點(diǎn) 陰離子交換劑 DEAESepharouse CL6B 弱堿性 pH:214 DEAE Sepharouse Fast FLow 陽(yáng)離子交換劑 CM Sepharouse CL6B 弱酸性 pH:214 優(yōu)點(diǎn)： 對(duì) pH及溫度的變化均較 穩(wěn)定 ，可在 pH3～ 10和 0～70℃ 范圍內(nèi)使用，改變離子強(qiáng)度或 pH時(shí)，床體積變化不大 交換劑堅(jiān)硬，顆粒呈微球型， 分辨率高 流速快， 吸附量大 特別適用于相對(duì)分子質(zhì)量大的蛋白質(zhì)和核酸等化合物的分離 聚苯乙烯 陰離子交換劑 Amberlite IRA amp。 一般分離蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì) 常用弱酸型或弱堿型離子交換劑 。 緩沖液不能干擾洗脫液的測(cè)定。用交聯(lián)葡聚糖離子交換劑和纖維素離子交換劑時(shí)，常用的柱高為 15～ 20cm。 洗脫 洗脫液 ?改變?nèi)芤旱?pH或改變離子強(qiáng)度 當(dāng)使用 陰離子交換劑 時(shí)，增加鹽離子濃度，則降低 pH值。 再生 對(duì)使用過的離子交換劑進(jìn)行處理，使其恢復(fù)原來性狀的過程。 （四）應(yīng)用實(shí)例 陰離子交換層析 從人血漿中分離得到血清白蛋白 (HSA)和免疫球蛋白 G(IgG) 25mmol／ L的乙酸鈉緩沖液充分透析血漿 用乙酸將血漿的 pH調(diào)至 ，除去沉淀 上陰離子交換柱 pH Ig G pH為 ，以階段洗脫的方式得到 HSA 降低 pH至 ，同時(shí)升高緩沖液的濃度至 150 mmol /L， 洗脫得到其他的糖蛋白 ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ 用 DEAESepharose CL6B柱大量分級(jí)人血漿蛋白 陽(yáng)離子交換層析 用 CM纖維素分離雞蛋清中的蛋白質(zhì)組份 表 雞蛋清中一些蛋白質(zhì)用 CM纖維素分離結(jié)果的分析 級(jí)分中的蛋白質(zhì) pI 洗脫緩沖液的pH 洗脫峰 pH 產(chǎn)量（ mg） 活性回收（ %） A．?dāng)M卵粘蛋白 87 B．?dāng)M卵粘蛋白 C．卵蛋白 A1 89 D．卵蛋白 A2 E．卵蛋白 A3 F．“球蛋白” G．卵轉(zhuǎn)鐵蛋白 87 H．卵轉(zhuǎn)鐵蛋白 I．“球蛋白” J．“球蛋白” K．“球蛋白” L．抗生物素蛋白 10 39 M．“球蛋白” N．溶菌酶 92 三、凝膠過濾層析 (exclusion chromatography) 凝膠層析又稱分子篩過濾、排阻層析等，依據(jù)是 多孔的載體對(duì)不同體積和不同形狀分子的排阻能力的不同 ， 從而對(duì)混合物進(jìn)行分離。即該成分的 Kd＝ 0。 一般物質(zhì)的 Kd值是 0Kd l。分析性實(shí)驗(yàn) 濃度低 ④ 離子強(qiáng)度 可防止蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間或與凝膠介質(zhì)之間的相互作用 常用鹽溶液： 20100mmol/L NaCl 濃度過高 引起凝膠柱床體積變化 （二）凝膠過濾層析的介質(zhì) 葡聚糖系列 瓊脂糖系列 聚丙烯酰胺系列 多孔硅膠 葡聚糖系列 以微生物產(chǎn)生的 葡聚糖 Dextran為原料 用 環(huán)氧氯丙烷為交聯(lián)劑 ，在堿性條件下交聯(lián)而成商品的凝膠，稱為 Sephadex 葡聚糖凝膠 (Sephadex )的物理特性 品 名 干膠顆粒 直徑 /μm 得水值 Wf/ 床體積 / 最適分段分離范圍 溶脹所需 時(shí)間 /h 最大流體 靜力壓 /Pa (cmH2O) 球蛋白分 子質(zhì)量／ Da 線性葡聚糖 分子質(zhì)量 /Da 20℃ lOO ℃ Sephadex G1O 40120 177。 911 150030000 50010000 6 2 9810(100) Sephadex G75 中粗 超細(xì) 40120 1040 177。 3040 5000800000 1000202200 72 5 981(10) 瓊脂糖系列 較常用的是 Pharmacia和 BioRad兩家的產(chǎn)品，前者生產(chǎn)的稱為 Sepharose，后者的產(chǎn)品為 BioGel A。 較常用的是 Pharmacia和 BioRad兩家的產(chǎn)品，前者生產(chǎn)的稱為 Sephacryl ，后者的產(chǎn)品為BioGel P。 選用 分級(jí)范圍較窄 的凝膠，且中間值 接近于目的蛋白的分子量 凝膠顆粒大小的選擇 優(yōu)點(diǎn) 缺點(diǎn) 小顆粒 分離效果好 流速慢 分離時(shí)間長(zhǎng) 大顆粒 流速快 區(qū)帶擴(kuò)散 洗脫峰平而寬 凝膠柱的制備 用于分組分離 短而粗 L/D值＜ 10 用于分級(jí)分離 L/D值比較大 對(duì)很難分離的組分一般需要 100cm左右長(zhǎng)的層析柱，其直徑在 1～ 5cm范圍內(nèi)，小于 1cm產(chǎn)生 管壁效應(yīng) ，大于 5cm則 稀釋現(xiàn)象 嚴(yán)重 。 保存 ? 液相中保存：于凝膠懸液中加入 防腐劑 或 高壓滅菌 后 4℃ 保存。可以用凝膠層析法。 天花粉毒蛋白的凝膠過濾分離 交聯(lián)葡聚糖凝膠 G50柱 ( 100 cm)用 50m mol/LTrisHCl, pH 天花粉硫酸銨糊 (90％飽和度的沉淀 )溶于 2m1平衡緩沖液中 上樣 洗脫天花粉毒蛋白 除去不溶物 ↓ ↘ ↘ ↓ 測(cè)定高分子物質(zhì)的分子量 測(cè) 大于 所用載體 上限 分子的洗脫體積 測(cè) 小于下限 的分子的洗脫體積 標(biāo)定凝膠過濾柱的 Vo 標(biāo)定凝膠過濾柱的 Vi 測(cè)定一系列 已知分子量的標(biāo)淮樣品 在柱上的洗脫體積 Ve 以 (VeVi)／ (VoVi)和1ogMw 作圖 測(cè)得了 待測(cè)分子量的樣品的 Ve 從 標(biāo)準(zhǔn)曲線上 可以 求得 未知樣品的分子量 藍(lán)色葡聚糖 氨基酸、有色鹽類 ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ 以標(biāo)準(zhǔn)樣品的分子量的 1ogMw對(duì) Ve作圖 or 洗脫液中蛋白質(zhì)濃度 高分子溶液的濃縮 將 SephadexG25或 50干膠 投入到 稀的高分子溶液 中 水分和低分子量的物質(zhì)就會(huì)進(jìn)入凝膠粒子內(nèi)部 高分子物質(zhì)則排阻在凝膠顆粒之外 離心或過濾 ，去除溶脹的凝膠 濃縮 的高分子溶液 ↓ 蛋白質(zhì)復(fù)性研究 變性蛋白加入凝膠柱 高濃度變性劑存在，蛋白呈無規(guī)則卷曲 變性蛋白 體積大，只能 進(jìn)入顆粒間隙 ，遷移速度快 變性劑 分子量小，進(jìn)入顆粒內(nèi)部 ，遷移速度慢 緩沖液洗脫蛋白 變性劑濃度降低， 轉(zhuǎn)成復(fù)性緩沖液 變性蛋白 復(fù)性 ，以 天然形態(tài)洗脫出柱 ↓ ↓ 四、疏水層析 (hydrophobic chromatography，HIC) （一）原理 疏水作用層析 （ HIC） 是根據(jù) 分子表面疏水性差別 來分離蛋白質(zhì)和多肽等生物大分子的一種層析方法。 隨著鹽濃度的提高，結(jié)合到固定化配基上的蛋白質(zhì)量也相應(yīng)提高 。 乙醇或去污劑的非極性區(qū)與結(jié)合的蛋白質(zhì) 競(jìng)爭(zhēng)疏水性配基 ，從而將蛋白質(zhì)替代下來。 優(yōu)點(diǎn) ? 提純效率高 ? 分離快速 （二）親和層析用基質(zhì) 具有 較好 的物理化學(xué) 穩(wěn)定性 能夠和 配體穩(wěn)定的結(jié)合 結(jié)構(gòu)為 均勻 的 多孔網(wǎng)狀 結(jié)構(gòu) 與樣品中