【正文】 用 醋酸銨等揮發(fā)性鹽類 緩沖液使層析柱平衡 上樣 用同樣緩沖液洗脫 收集的洗脫液用冷凍干燥法除去揮發(fā)性鹽類 對于鹽濃度低時易沉淀的蛋白質(zhì)： 分離提純 凝膠過濾的載體可以根據(jù)它們的孔徑分為很多種不同的規(guī)格。每種規(guī)格都有其特定的分級的范圍， 一旦超出分組范圍 ，不論是其上限還是下限，即使分子量有大有小，但載體的排阻情況基本相同 ，就 不能分離 。 在凝膠過濾層析時，要根據(jù)所要純化的樣品的分子量選擇所用的凝膠過濾的基質(zhì) 。 天花粉毒蛋白的凝膠過濾分離 交聯(lián)葡聚糖凝膠 G50柱 ( 100 cm)用 50m mol/LTrisHCl, pH 天花粉硫酸銨糊 (90％飽和度的沉淀 )溶于 2m1平衡緩沖液中 上樣 洗脫天花粉毒蛋白 除去不溶物 ↓ ↘ ↘ ↓ 測定高分子物質(zhì)的分子量 測 大于 所用載體 上限 分子的洗脫體積 測 小于下限 的分子的洗脫體積 標(biāo)定凝膠過濾柱的 Vo 標(biāo)定凝膠過濾柱的 Vi 測定一系列 已知分子量的標(biāo)淮樣品 在柱上的洗脫體積 Ve 以 (VeVi)／ (VoVi)和1ogMw 作圖 測得了 待測分子量的樣品的 Ve 從 標(biāo)準(zhǔn)曲線上 可以 求得 未知樣品的分子量 藍(lán)色葡聚糖 氨基酸、有色鹽類 ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ 以標(biāo)準(zhǔn)樣品的分子量的 1ogMw對 Ve作圖 or 洗脫液中蛋白質(zhì)濃度 高分子溶液的濃縮 將 SephadexG25或 50干膠 投入到 稀的高分子溶液 中 水分和低分子量的物質(zhì)就會進(jìn)入凝膠粒子內(nèi)部 高分子物質(zhì)則排阻在凝膠顆粒之外 離心或過濾 ，去除溶脹的凝膠 濃縮 的高分子溶液 ↓ 蛋白質(zhì)復(fù)性研究 變性蛋白加入凝膠柱 高濃度變性劑存在，蛋白呈無規(guī)則卷曲 變性蛋白 體積大，只能 進(jìn)入顆粒間隙 ，遷移速度快 變性劑 分子量小，進(jìn)入顆粒內(nèi)部 ，遷移速度慢 緩沖液洗脫蛋白 變性劑濃度降低， 轉(zhuǎn)成復(fù)性緩沖液 變性蛋白 復(fù)性 ，以 天然形態(tài)洗脫出柱 ↓ ↓ 四、疏水層析 (hydrophobic chromatography，HIC) （一）原理 疏水作用層析 （ HIC） 是根據(jù) 分子表面疏水性差別 來分離蛋白質(zhì)和多肽等生物大分子的一種層析方法。 疏水性弱的物質(zhì)，在較高離子強度的溶液時被洗脫下來，當(dāng)離子強度降低時，疏水性強的物質(zhì)才隨后被洗脫下來。 影響疏水作用的因素： 蛋白質(zhì)的疏水性、蛋白質(zhì)的環(huán)境 Water molecules Solute Surface exposed hydrophobic groups Ligand Water molecules in bulk （二）疏水基質(zhì) 人工合成聚合物類 瓊脂糖 纖維素 聚苯乙烯 聚丙烯酸甲酯類 多糖類 殼聚糖 應(yīng)用最廣泛 良好的生物相容性和化學(xué)穩(wěn)定性 （三）疏水配基 烷基鏈配基 芳基配基 高分子配基 柱： HiPrep 16/10 樣品 : 細(xì)胞色素 C(1)，溶菌酶（ 2），核糖核酸酶（ 3）， 靡蛋白酶原（ 4） （四）基本操作 ?平衡 Equilibration ?上樣 Sample application ?洗雜 Washing ?洗脫 Elution Equilibration 1. Equilibration 2. Sample application 3. Washing 4. Elution Water molecules Hydrophobic ligand Gel matrix Sample application 1. Equilibration 2. Sample application 3. Washing 4. Elution Gel matrix Proteins Hydrophobic groups Washing out unbound material 1. Equilibration 2. Sample application 3. Washing 4. Elution Conc. salt Abs Nonbound proteins 1. Equilibration 2. Sample application 3. Washing 4. Elution Elution Target elutes Conc. salt Abs Elution 1. Equilibration 2. Sample application 3. Washing 4. Elution Conc. salt Abs More strongly bound proteins 層析柱的選擇 柱床高度通常為 5～ 15cm 對一個優(yōu)化好的分離方案進(jìn)行 規(guī)模放大 時，可保持柱高不變， 增加柱的直徑 粗柱子（內(nèi)徑為 ～ ）適合進(jìn)行 HIC層析。 緩沖液的選擇 往平衡的緩沖液和樣品中加入一種 鹽析鹽 ，有利于固定化配基與蛋白質(zhì)的相互作用。 隨著鹽濃度的提高，結(jié)合到固定化配基上的蛋白質(zhì)量也相應(yīng)提高 。 洗脫時，洗脫液離子強度逐漸降低。 ?最常用的鹽： (NH4)2SO4 、 Na2SO4 和 NaCl 緩沖液的選擇 隨著 pH的升高，疏水作用相應(yīng)下降 由于 pH升高時，帶點基團增加，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)的親水性增加 在中性 pH條件下與疏水相互作用介質(zhì)不結(jié)合的蛋白質(zhì)，在酸性 pH條件下則能夠結(jié)合 ﹡ 洗脫時，洗脫液 pH逐漸升高。 蛋白質(zhì)的洗脫 低濃度的 水溶性乙醇 、 去污劑 和具有 鹽溶作用的鹽 破壞水的結(jié)構(gòu)、降低表面張力，從而削弱疏水相互作用。 乙醇或去污劑的非極性區(qū)與結(jié)合的蛋白質(zhì) 競爭疏水性配基 ，從而將蛋白質(zhì)替代下來。 HIC柱的再生、清潔和貯存 輕度 污染時 蒸餾水 洗滌 污染物 緊密結(jié)合 時 6 mol/L尿素 或 6 mol/L鹽酸胍 洗滌＋起始緩沖液或貯存緩沖液洗滌 NaOH可用于溶解變性和沉淀的蛋白質(zhì)及脂類 未使用的介質(zhì)儲存在 封閉的容器 中，在 425℃ 的條件下保存 用過的介質(zhì)應(yīng)貯存在含有適當(dāng) 抑菌劑 的溶液中，在4 ～ 8℃ 的條件下保存， 不得冷凍 五、親和層析 (affinity chromatography) （一）原理 親和層析 利用生物大分子與其配體之間具有專一性親和力而設(shè)計的層析技術(shù)。 親和力 生物分子間存在很多特異性的相互作用，如抗原 抗體、酶 底物或抑制劑、激素 受體等，它們之間都能夠 專一而可逆 的結(jié)合。 分離原理 通過將具有親和力的兩個分子中一個固定在不溶性基質(zhì)上，利用分子間親和力的特異性和可逆性，對另一個分子進(jìn)行分離純化。 優(yōu)點 ? 提純效率高 ? 分離快速 （二）親和層析用基質(zhì) 具有 較好 的物理化學(xué) 穩(wěn)定性 能夠和 配體穩(wěn)定的結(jié)合 結(jié)構(gòu)為 均勻 的 多孔網(wǎng)狀 結(jié)構(gòu) 與樣品中的各個組分均 沒有明顯的非特異性吸附 各類基質(zhì)優(yōu)缺點 優(yōu)點 缺點 纖維素 價格低、活性基團較多 非特異性吸附強、穩(wěn)定性和均一性較差 交聯(lián)葡聚糖 穩(wěn)定性較好 孔徑較小、穩(wěn)定性不好 聚丙烯酰胺 同上 同上 瓊脂糖 非特異性吸附低、穩(wěn)定性好、孔徑均勻適當(dāng)、宜于活化 多孔玻璃 機械強度好，化學(xué)穩(wěn)定性好 活性基團較少、對蛋白質(zhì)有較強的吸附作用 基質(zhì)的活化 溴化氰活化 環(huán)氧乙烷基活化 指通過對基質(zhì)進(jìn)行一定的化學(xué)處理，使基質(zhì)表面上的一些 化學(xué)基團 轉(zhuǎn)變?yōu)?易于和特定配體結(jié)合 的活性基團 。 多種商品化的活化基質(zhì) （三）配體 與待分離的物質(zhì)有適當(dāng)?shù)挠H和力 與待分離的物質(zhì)之間的親和力要有較強的特異性 與基質(zhì)穩(wěn)定的共價結(jié)合 自身應(yīng)具有較好的穩(wěn)定性 配體的分類 特異性配體 只與 單一 或 很少種類 的蛋白質(zhì)等生物大分子結(jié)合的配體 eg. 抗原和抗體、酶和它的抑制劑 通用性配體 特異性不是很強，能和 某一類 的蛋白質(zhì)等生物大分子結(jié)合的配體 eg. 凝集素可以結(jié)合各種糖蛋白 配體 待純化的蛋白質(zhì) 配體 待純化的蛋白質(zhì) 抗原 特定單克隆抗體或多克隆抗體 肝素 凝聚因子、脂酶、結(jié)締組織蛋白酶、 DNA聚合酶 單克隆抗體 特定抗原 膽固醇 膽固醇受體、膽固醇結(jié)合蛋白 蛋白質(zhì) A/蛋白質(zhì) G 免疫球蛋白 脂肪酸 脂肪酸結(jié)合蛋白、白蛋白 蛋白酶抑制劑 蛋白酶 核苷酸 核苷酸結(jié)合蛋白、需核苷酸的酶 磷酸 磷酸酶 苯基硼酸鹽 糖蛋白 三嗪染料 脫氫酶、激酶、聚合酶、限制酶、干擾素 凝集素 糖蛋白 抗生物素蛋白 含生物素的酶 糖 凝集素、糖苷酶 蛋白質(zhì)親和層析中的合適配體 （四）基本操作 選擇適當(dāng)?shù)呐潴w 將配體固定化到基質(zhì)上 將目的蛋白混合液加樣到基質(zhì)上 除去非特異性結(jié)合的蛋白質(zhì) 洗脫純的目的蛋白 上樣 層析柱較短，通常 10cm 左右 樣品液的濃度不宜過高 上樣時流速比較慢 樣品緩沖液中有一定的的離子強度 上樣時選擇適當(dāng)較低的溫度 洗脫 特異性洗脫 指利用洗脫液中的物質(zhì)與待分離物質(zhì)或與配體的親和特性而將待分離物質(zhì)從親和吸附劑上洗脫下來。 非特異性洗脫 指通過改變洗脫緩沖液 pH、離子強度、溫度等條件，降低待分離物質(zhì)與配體的親和力而將待分離物質(zhì)洗脫下來。 特異性洗脫 優(yōu)點： 特異性強，可以進(jìn)一步消除非特異性吸附的影響，從而得到較高的分辨率。 可避免蛋白質(zhì)變性 缺點： 較長的時間、較大的洗脫條件。 改善方法： 選擇親和力強的物質(zhì)洗脫、加大洗脫液濃度 特異性洗脫 非特異性洗脫 與配體親和力較小 連續(xù) 大體積平衡緩沖液沖洗 ，不影響活性，但洗脫體積較大，待分離物質(zhì)濃度較低。 配體結(jié)合較強時 適當(dāng)?shù)?pH、離子強度洗脫 ，注意盡量不影響待分離物質(zhì)的活性 與配體結(jié)合非常牢固時 使用較強的 酸、堿 或在洗脫液中加入 脲、胍等變性劑 ，使蛋白質(zhì)等待分離物質(zhì)變性，洗脫后再復(fù)性 吸附劑的再生和保存 再生 用 大量 的洗脫液或 較高濃度 的鹽溶液洗滌，再用平衡液重新平衡 嚴(yán)重的不可逆吸附時，使用 高濃度的鹽溶液、尿素等變性劑 或加入適當(dāng)?shù)?非專一性蛋白酶 保存 加入 %的疊氮化鈉， 4176。 C 下保存 五、親和層析用于蛋白質(zhì)分離的實例 免疫親和層析 凝集素和糖蛋白親和層析 含有輔酶的酶類的親和層析 酶和蛋白類型抑制劑的親和層析 肝素為配體的親和層析 染料配體親和層析 金屬螯合層析 六、吸附層析 (absorption chromatography) （一）原理 蛋白質(zhì)分子通過各種次級鍵的作用能吸附在某些吸附劑上，根據(jù)不同蛋白質(zhì)對固定相 (吸附劑 ) 的 吸附程度不同 ，以及其在相應(yīng)的流動相 (溶劑 )中溶解度的差異來實現(xiàn)，經(jīng)反復(fù)的 吸附 — 解吸 — 再吸附 — 再解吸 的過程，達(dá)到分離目的。 無化學(xué)鍵引入，只存在相對較弱的 氫鍵 、 范德華力 和疏水作用力 相互作用。 （二）吸附劑 水合磷酸鈣 羥基磷灰石 （三）優(yōu)點 操作方便 吸附劑易得、價格低廉 能分離離子交換層析和凝膠過濾不能分離的蛋白質(zhì) 八、高效液相層析 （ High Performance Liquid Chromatography ， HPLC） （一）原理 高效液相色譜法是以液體作為流動相，并采用顆粒極細(xì)的高效固定相的柱色譜分離技術(shù)。 高效液相色譜對樣品的適用性廣，不受分析對象揮發(fā)性和熱穩(wěn)定性的限制，因而彌補了氣相色譜法的不足。 目前已知的有機化合物中，可用氣相色譜分析的約占20%，而 80%則需用高效液相色譜來分析。 特點： 高壓、高效、高速，高沸點、熱不穩(wěn)定