【正文】 中的分配（含量對比）不同 ，而且隨流動相向前移動，各組份不斷地在兩相中進(jìn)行再分配，從而達(dá)到將各組份分離的目的。 一、層析概述 層析分離蛋白質(zhì)的原理 待分離蛋白質(zhì)溶液（流動相）經(jīng)過一個固態(tài)物質(zhì)（固定相）時，根據(jù)溶液中待分離的蛋白質(zhì)顆粒大小、電荷多少及親和力等，使待分離的蛋白質(zhì)組分在兩相中反復(fù)分配，并以不同速度流經(jīng)固定相而達(dá)到分離蛋白質(zhì)的目的 。 （二）層析的分類 按 固定相 基質(zhì)的形式： 柱層析、紙層析和薄層層析 根據(jù)流動相的形式： 液相層析、氣相層析 凝膠過濾 原理 吸附層析 疏水層析 分配層析 親和層析 離子交換 （三）層析前蛋白質(zhì)處理 主要是利用 鹽析法、等電點沉淀、有機(jī)溶劑沉淀 等方法，使目的蛋白與其它較大量的雜蛋白分開，這些方法的特點是簡便、處理量大、既能除去大量雜質(zhì)，又能濃縮蛋白質(zhì)，但分辨率低。 （四）層析基本操作過程 裝置選擇 上樣和洗脫 結(jié)果檢測 上樣均一性 洗脫裝置 目的不同 檢測方法不同 活性檢測 基質(zhì)均勻性 柱層析的 L/d比值 柱層析的 L/d比值 洗脫裝置 ? 不改變?nèi)軇w系 依靠液面的水位差產(chǎn)生的 靜壓力 致使洗脫液不斷流經(jīng)層析柱 缺點：隨著溶液的流去，水位差也逐漸減小，流速也在變小。 改善： 蠕動泵或恒流泵 維持流速恒定的簡易裝置 改變?nèi)軇┫到y(tǒng) ? 分級洗脫 在一個溶劑系統(tǒng)洗滌后，改用另一溶劑系統(tǒng)。 缺點： 蛋白質(zhì)和層析基質(zhì)的結(jié)合強度相差并不很大 ，溶劑系統(tǒng)的改變又不可能過細(xì)過密同一個洗脫級分中就可能含有兩種或兩種以上的蛋白質(zhì)，達(dá)不到分離純化的目的。 遞減 遞增 pH 陰離子交換樹脂 陽離子交換樹脂 離子強度 疏水層析 離子交換層析 改變?nèi)軇┫到y(tǒng) ? 梯度洗脫 一種溶液以 恒定的速度 連續(xù)地進(jìn)入處于溫和攪拌的盛有另一種溶液的容器中，經(jīng) 混合后的液體以同速度沉入層析柱 作為洗脫液，在這樣所得到的洗脫液中一種溶液的濃度以 線性梯度方式 連續(xù)地發(fā)生改變。 注意：梯度洗脫呈現(xiàn)一個峰，但有可能存在兩個性質(zhì)接近的蛋白質(zhì)。 線性梯度洗脫裝置 ?性能未知樣品的蛋白質(zhì)分離： 改變緩慢的梯度洗脫 → 若為單峰：分級洗脫 結(jié)果檢測 活性檢測 比活 沒有提高 目的蛋白與雜蛋白 并 沒有分開 比活有所提高，但總 活性回收很低 目的蛋白有 損失 或有 失活 現(xiàn)象 測定蛋白質(zhì) 一級結(jié)構(gòu) 時，可 不考慮 目的蛋白的生物 活性 結(jié)果保存 薄層層析 amp。紙層析 照相保存 掃描儀轉(zhuǎn)為圖形 積分儀變成數(shù)據(jù) 柱層析 檢測器、記錄儀和積分儀處理 層析裝置的儀器化 HPLC ?與微機(jī)、質(zhì)譜等連用 二、離子交換層析 (ion exchange chromatography， IEX) （一）原理 離子交換層析 (ion exchange chromatography， IEX) 技術(shù) 是以離子交換纖維素或以離子交換葡聚糖凝膠為固定相 ， 以蛋白質(zhì)等樣品為移動相 ， 分離和提純蛋白質(zhì) 、 核酸 、 酶 、 激素和多糖等的一項技術(shù) 。 原理：利用 蛋白質(zhì)的電荷 和 層析載體的電荷 間的相互作用 ， 進(jìn)而達(dá)到分離純化的目的 。 惰性支持物 (高分子聚合物基質(zhì) ) 解離基團(tuán) (配基 ) 共價結(jié)合 ?平衡離子是結(jié)合于配基上的相反離子，它能與溶液中其它的離子基團(tuán)發(fā)生可逆的交換反應(yīng)。 ?陽離子交換劑 ：平衡離子帶正電的離子交換劑，能與帶正電的離子基團(tuán)發(fā)生交換作用 ?陰離子交換劑： 平衡離子帶負(fù)電的離子交換劑，與帶負(fù)電的離子基團(tuán)發(fā)生交換作用 pH值的影響 NH3 R COOH + NH3 R COO + R NH2 COO Low pH Positive charge High pH Negative charge Hydrogen gained Hydrogen lost 離子溶度影響 → 離子濃度增加 + 離子取代順序 （二）離子交換劑的基本類型 根據(jù)可供交換的離子性質(zhì)： ?陽離子交換劑 ?陰離子交換劑 按解離基團(tuán)的解離 pH值： ?強酸型交換劑 ?強堿型交換劑 ?弱酸型交換劑 ?弱堿型交換劑 配基 結(jié)構(gòu) pK 分類 簡稱 硫酸基 (sulphate) OSO3H 2 強酸 S 磺酸基 (sulphonate) (CH2) nSO3H 2 強酸 SM(n = 1) ， SE(n = 2) ， SP(n = 3) ， SB(n = 4) 磷酸基 (phosphate) OPO3H2 2和 6 中等酸性 P 羧酸基(carboxylate) (CH2) nCOOH 弱酸 CM(n = 1) 叔胺基 (tertiary amine) 2(CH2) nN+ H(C2H5)2 弱堿 DEAE(n = 2) 季胺基 (quaternary amine) 2(CH2) n2N+ ≡(R)3 9 強堿 Q ， QAE 離子交換劑的基質(zhì) 瓊脂糖 離子交換劑 離子交換 交聯(lián)葡聚糖 聚苯乙烯 離子交換 纖維素 離子交換纖維素 交換劑 名 稱（纖維素） 作 用 基 團(tuán) 特 點 陰離子 交換劑 二乙氨基乙基 DEAE+OC2H4N+(C2H5)2 最常用在 三乙氨基乙基 DEAE+OC2H4N+(C2H5)3 氨乙基 AE+OC2 H4NH2 胍乙基 強堿性、極高 pH仍有效 陽離子 交換劑 羧甲基 CM— OCH2COO— 最常用在 pH4以上 磷酸 P－ O PO2－ 用于低 pH 磺甲基 SM－ OCH2SO3－ 磺乙基 SE－ OC2H4SO3－ 強酸性用于極低 pH 常用： DEAE纖維素（二乙基氨基纖維素） CM纖維素（羧甲基纖維素） 優(yōu)點： ?開放性長鏈和松散的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，有較大的表面積，吸附容量大，通透性好，大分子可自由通過，使它的 實際交換容量要比離子交換樹脂大的多。 ?親水性，對蛋白質(zhì)等生物大分子物質(zhì)吸附的不太牢，用較溫和的洗脫條件就可達(dá)到分離的目的，因此 不致引起生物大分子物質(zhì)的變性和失活。 ?回收率高 缺點： ?交換劑膨脹 交聯(lián)葡聚糖 類 型 性 能 離子基因 反離子 總交換容量 （毫克當(dāng)量 /g） DEAEsephadexA25 弱堿性、陰離子交換劑 DEAE+ Cl— 177。 DEAEsephadexA50 QAEsephadexA25 弱堿性、陰離子交換劑 QAE+ Cl— 177。 QAEsephadexA50 CM sephadex C25 弱堿性、陽離子交換劑 CM— Na+ 177。 CM sephadex C50 SP sephadex C25 強堿性、陽離子交換劑 SP— Na+ 177。 SP sephadex C50 優(yōu)點： ?不會引起被分離物質(zhì)的變性或失活 ?非特異性吸附 ?交換容量大 ?同時具有分子篩效應(yīng) 離子交換葡聚糖的選用： 一般根據(jù)蛋白質(zhì)的分子量而定 ?中等分子量（ 30000202200）一般選 A50和 C50 ?低分子量（＜ 30000）和高分子量（＞ 202200） 均宜 選用 A25和 C25。 瓊脂糖離子交換劑 交換劑 名 稱 特點 陰離子交換劑 DEAESepharouse CL6B 弱堿性 pH:214 DEAE Sepharouse Fast FLow 陽離子交換劑 CM Sepharouse CL6B 弱酸性 pH:214 優(yōu)點： 對 pH及溫度的變化均較 穩(wěn)定 ，可在 pH3～ 10和 0～70℃ 范圍內(nèi)使用，改變離子強度或 pH時，床體積變化不大 交換劑堅硬，顆粒呈微球型， 分辨率高 流速快， 吸附量大 特別適用于相對分子質(zhì)量大的蛋白質(zhì)和核酸等化合物的分離 聚苯乙烯 陰離子交換劑 Amberlite IRA amp。 Dowex eg. Dowex 4100 陽離子交換劑 Amberlite IRC amp。 Dowex 強陰離子交換劑 交聯(lián)度為 4% 顆粒度為 50100目 其他 聚乙烯醇 DEAEToyopearl amp。 CMToyopearl 富羥基 高親水性 兼性離子交換劑 基質(zhì)上連有 β丙氨酸 、 對氨基苯磺酸 、 精氨酸 等偶極離子 （三）基本操作 緩沖液的選擇 層析柱的選擇 洗脫流速 ↓ 加樣 洗脫 洗脫液的監(jiān)測收集及組分鑒定 離子交換劑的清洗、再生和保存 ↓ ↓ ↓ ← 離子交換劑的處理 ↑ 離子交換劑的選擇 離子交換劑的選擇 配基的選擇 取決于被分離的物質(zhì)在其穩(wěn)定的 pH下所帶的電荷，如果帶正電，則選擇陽離子交換劑；如帶負(fù)電，則選擇陰離子交換劑。 一般分離蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì) 常用弱酸型或弱堿型離子交換劑 。 ? 基質(zhì)的選擇 價格 分辨率和穩(wěn)定性 特點 纖維素離子交換劑 較低 較低 適于初步分離和大量制備 葡聚糖離子交換劑 適中 適中 受外界影響較大，體積可能隨離子強度和 pH變化有較大改變，影響分辨率 瓊脂糖離子交換劑 較貴 較高 穩(wěn)定、分辨率高、吸附量大 顆粒大小 分辨率 平衡時間 流速 應(yīng)用 小顆粒 高 長 慢 需要高分辨率的分析或分離 大顆粒 低 短 快 分辨率要求不高的大規(guī)模制備性分離 離子交換劑的處理 酸堿浸泡 進(jìn)一步去除雜質(zhì)，并使離子交換劑帶上需要的平衡離子，一般陽離子交換劑最后用堿 NaOH處理，陰離子交換劑最后用酸 HCl處理。 ? 膨化 將干粉在水中充分溶脹，以使離子交換劑顆粒的孔隙增大，具有交換活性的配基充分暴露出來。 ?水懸浮 去除雜質(zhì)和細(xì)小顆粒 緩沖液的選擇 離子強度和 pH 保證各個待分離物質(zhì)的穩(wěn)定；使待分離樣品與離子交換劑有較穩(wěn)定的結(jié)合，而盡量使雜質(zhì)不與離子交換劑結(jié)合或結(jié)合不穩(wěn)定； 注意 平衡緩沖液中不能有與離子交換劑結(jié)合力強的離子，否則會大大降低交換容量，影響分離效果。 緩沖液不能干擾洗脫液的測定。 層析柱的選擇 親和力相差不多而需要交換劑的體積較大 增加柱長為宜，使待分離的組分被 洗脫后再結(jié)合于交換劑上的概率增加 ，柱的直徑與高度的比以1： 20左右為宜。 采用離子強度較大的梯度洗脫 選用 粗而短 的柱子為宜。因為當(dāng)柱上洗脫液的離子強度高到足以完全取代被吸附的離子時，這些 被置換的離子則以同洗脫液等速率從柱上向下移動 ，如果 柱細(xì)長 ，即從脫附到流出之間的距離長，使脫附的離子擴(kuò)散的機(jī)會增加，結(jié)果造成分離峰過寬，降低分辨率。用交聯(lián)葡聚糖離子交換劑和纖維素離子交換劑時，常用的柱高為 15～ 20cm。 上樣 樣品應(yīng)與起始緩沖液有 相同的 pH和離子強度 離子強度應(yīng)低 ，可用透析、凝膠過濾或稀釋法達(dá)此目的。 不溶物應(yīng)在透析后或凝膠過濾前，以離心法除去。 上樣量要適當(dāng)，不要超過柱的負(fù)荷能力，通常上樣量為交換劑交換總量的 1％ 5％ 。 洗脫 洗脫液 ?改變?nèi)芤旱?pH或改變離子強度 當(dāng)使用 陰離子交換劑 時，增加鹽離子濃度，則降低 pH值。 當(dāng)使用 陽離子交換劑 時，增加鹽離子濃度，則升高 pH值 ?親和洗脫 目的蛋白與加入離子發(fā)生 特異性相互作用