【正文】 第三章 蛋白質(zhì)的分離 提純及檢測(cè) 第一節(jié) 引言 第二節(jié) 前處理 第三節(jié) 蛋白質(zhì)的粗分離 第四節(jié) 蛋白質(zhì)的層析分離 第五節(jié) 蛋白質(zhì)的電泳分離 第六節(jié) 蛋白質(zhì)的結(jié)晶 第七節(jié) 蛋白質(zhì)的檢測(cè) 第一節(jié) 引言 一、蛋白質(zhì)的存在 ? 蛋白質(zhì)存在于所有的生物細(xì)胞中，是構(gòu)成生物體最基本的結(jié)構(gòu)物質(zhì)和功能物質(zhì)。 ? 一般蛋白質(zhì)，酶、抗體、激素蛋白、毒素蛋白等 ? 存在部位 – 器官、組織、體液 – 胞內(nèi)、胞外 一、蛋白質(zhì)的存在 ? 存在形式 – 游離狀態(tài) 消化液中的蛋白 – 結(jié)合狀態(tài) 蛋白與蛋白 蛋白與非蛋白 二、為什么要分離提純蛋白質(zhì) ? ? 農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的需要 – (1)對(duì)農(nóng)副產(chǎn)品的綜合利用需要高活性的酶制劑。 – (2)用酶分析法測(cè)定家畜家禽以及農(nóng)作物中某種物質(zhì)的含量，需要用高純度的酶制劑。 二、為什么要分離提純蛋白質(zhì) ? ? 工業(yè)生產(chǎn)的需要 – 食品、發(fā)酵、紡織、制革等工業(yè)，需要大量的高活性的酶制劑。 – 淀粉酶、蛋白酶、果膠酶、葡萄糖氧化酶、溶菌酶、葡萄糖異構(gòu)酶 二、為什么要分離提純蛋白質(zhì) ? ? 醫(yī)療上的需要 – 人尿激酶治療腦血栓 – 用豬心細(xì)胞色素 C治療腦震蕩心力衰竭 – 用豬胰島素治療糖尿病 二、為什么要分離提純蛋白質(zhì) ? ? 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能研究及基因工程研究的需要 – 均一的蛋白制劑 – 工具酶 – 高純度的標(biāo)準(zhǔn)蛋白 三、對(duì)蛋白質(zhì)分離提純的要求 ? 純度 – 決定于研究的目的和應(yīng)用上的要求 ? 活性 – 要求蛋白質(zhì)保持天然構(gòu)象狀態(tài)，有高度的生物活性 ? 收率 – 收率越高越好 – 提純步驟愈多，則損失愈大 – 作為均一制劑，一般收率在 520％，最高可以達(dá)到 50％左右。 四、蛋白質(zhì)分離提純的一般程序 準(zhǔn)備工作： ? 選材，處理； ? 建立適當(dāng)?shù)募?xì)胞破碎和蛋白質(zhì)抽提方法； ? 建立一系列的分離提純和濃縮的方法； ? 建立靈敏而方便的分析方法，以估計(jì)每一個(gè)分離提純步驟的提純倍數(shù)和收率； ? 建立鑒定純度的方法 (如： SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳、等電聚焦等 )，以鑒定蛋白質(zhì)制劑的純度 。 四、蛋白質(zhì)分離提純的一般程序 蛋白質(zhì)分離提純的四個(gè)階段： ? 第一階段 (前處理 )： – 選材，破碎，抽提，離心分離，得無(wú)細(xì)胞抽提液。 胞外蛋白不須細(xì)胞破碎。 ? 第二階段 (粗分級(jí) )： – 根據(jù)不同蛋白質(zhì)的溶解度差異，采用適當(dāng)?shù)某恋矸?，?duì)所需蛋白質(zhì)進(jìn)行初步的分離提純。 – 如：鹽析法、等電點(diǎn)法、有機(jī)溶劑沉淀法、選擇性變性法，以及選擇性沉淀法等。 – 適合于處理大量的樣品溶液。 四、蛋白質(zhì)分離提純的一般程序 ? 第三階段 (細(xì)分級(jí) )： – 經(jīng)過(guò)粗分離得到的蛋白質(zhì)制劑是不純的 – 細(xì)分級(jí)可以采用適當(dāng)?shù)?柱層析法 。 ? 如：離子交換柱層析 (DEAE纖維素、 CM纖維素 )、分子篩層析 (Sephadex)、吸附層析 (羥基磷灰石 )、疏水吸附層析、親和層析、抗原抗體法等。 ? 柱層析法對(duì)蛋白質(zhì)的分離提純效果很好，但不能處理大量的樣品溶液 – 制備性聚丙烯酰胺 凝膠電泳 ，或 蔗糖密度梯度等電聚焦法 進(jìn)一步提純。 ? 此二法只能處理少量樣品，所以在提純的后期使用，比較合適。 – 采用 結(jié)晶法 對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)一步提純。 ? 蛋白質(zhì)制劑必須達(dá)到較高純度才能進(jìn)行結(jié)晶。所以，結(jié)晶法是在提純的后期使用的。 四、蛋白質(zhì)分離提純的一般程序 ? 第四階段 (質(zhì)量鑒定 )：純度、濃度 – SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳法、等電聚焦法、超離心沉降法、免疫電泳法、酶活力法、蛋白質(zhì)化學(xué)結(jié)構(gòu)分析法等。 – 一般需要用兩種或更多的方法鑒定蛋白質(zhì)制劑的純度。 – 經(jīng)常使用 Folin酚法，雙縮脲法、紫外吸收法考馬斯亮藍(lán)染色法 測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。 – 酶需要測(cè)定比活力及酶溶液的蛋白質(zhì)濃度。 四、蛋白質(zhì)分離提純的一般程序 防止蛋白質(zhì)變性的措施： ? 低溫 (0℃ 一 4℃) 操作，防止熱變性和蛋白水解酶水解。 ? 嚴(yán)格控制 pH值，防止過(guò)酸過(guò)堿對(duì)蛋白質(zhì)的變性作用。 ? 攪拌要緩慢，防止泡沫表面張力引起蛋白質(zhì)變性。 四、蛋白質(zhì)分離提純的一般程序 防止蛋白質(zhì)變性的措施： ? 防止蛋白質(zhì)自發(fā)變性，可以采取下列措施： – (1)加入低分子量物質(zhì) (如蔗糖和甘油等 )或加入純化的蛋白質(zhì) (如牛血清白蛋白、明膠等 )，以提高蛋白質(zhì)濃度，減少水的傷害。 – (2)少數(shù)蛋白質(zhì)必須在高離子強(qiáng)度的極性介質(zhì)中才能保持活性，可以加 KCI，或 NaCl， (NH4)2SO4。 – (3)有的蛋白質(zhì)需要加入二價(jià)金屬離子 (如 Mg2+、 Ca2+等 )才能保持穩(wěn)定性。 – (4)某些酶的提純和保存，需要加入底物，才能穩(wěn)定。 四、蛋白質(zhì)分離提純的一般程序 需要額外注意的兩個(gè)問(wèn)題： ? 天然構(gòu)象的保持 ? 多亞基多功能寡聚酶 第二節(jié) 前處理 一、材料的選擇 二、細(xì)胞破碎 三、抽提 第二節(jié) 前處理 一、材料的選擇 ? 選材的原則是： – (1)材料中所需蛋白質(zhì)的含量要高； – (2)材料易得。 一、材料的選擇 材料中蛋白質(zhì)含量的多少與下列因素有關(guān)： ? 種屬差異 ，如人與牛的同一種蛋白質(zhì)，其含量常常相差十倍之多； ? 個(gè)體差異 ，在不同個(gè)體中，蛋白質(zhì)含量也有明顯的不同； ? 由于 性別、年齡、季節(jié)、飼料條件 的不同，蛋白質(zhì)的含量也會(huì)發(fā)生變化。 一、材料的選擇 從實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)取材時(shí)，要注意三點(diǎn)： ? (1)要注意動(dòng)物本身的生理特征； ? (2)要盡可能在接近正常狀態(tài)下取出器官或組織； ? (3)死后的變化要限制在最小限度內(nèi)，為此必須迅速取出器官或組織，充分脫血，立即使用，或放在 10℃ ～ 50℃ 的冷庫(kù)中凍存。 二、細(xì)胞破碎 根據(jù)實(shí)驗(yàn)材料的性質(zhì)，選擇破碎方法 ? 肝、腦、腎、脾等軟組織，容易破碎，可以用勻漿器研磨； ? 肌肉不易破碎，可以先用絞肉機(jī)絞碎，然后用組織搗碎機(jī)粉碎； ? 紅血球，其細(xì)胞膜脆弱，可以用低滲透壓法破碎。 ? 植物細(xì)胞，韋林氏搗切器、壓榨機(jī)、石英砂研磨。 ? 酵母和細(xì)菌細(xì)胞，可用法蘭西壓榨機(jī)(Frenchpress)、 Manton— Gaulin勻漿器、振動(dòng)研磨機(jī)、超聲波破碎、反復(fù)凍融法。 ? 化學(xué)法（去垢劑）、生物學(xué)方法（溶菌酶）。 二、細(xì)胞破碎 檢查細(xì)胞的破碎程度的方法： ? (1)顯微鏡觀(guān)察； ? (2)用分度管檢查 – 將破碎細(xì)胞的懸浮液裝于分度管中，離心 3分鐘，未碎的完整細(xì)胞首先沉降，在它上面是細(xì)胞碎片，再上面是細(xì)胞質(zhì)部分。每一層的相對(duì)含量即表示細(xì)胞破碎程度。 三、抽提 抽提就是將破碎細(xì)胞中的蛋白質(zhì)溶解在適當(dāng)?shù)娜軇┲小? 根據(jù)所需蛋白質(zhì)溶解性，采用適當(dāng)?shù)娜軇┏樘帷? ? 水溶性的 清蛋白 (如：血清白蛋白、卵清蛋白等 )可以用水抽提； ? 不溶于水的鹽溶性 球蛋白 (如：血紅蛋白、肌紅蛋白等 )可以用稀中性鹽溶液 (如 )抽提； 三、抽提 ? 不溶于水和鹽溶液但可溶于稀堿溶液的 米谷蛋白和麥谷蛋白 ，可以用稀堿溶液抽提； ? 不溶于水和中性鹽溶液，但能溶于 70～ 80％乙醇溶液中的 醇溶蛋白 (如醇溶谷蛋白 )，可以用 70～80％乙醇溶液抽提； ? 脂蛋白 要用表面活性劑 (即洗滌劑 )才能抽提出來(lái)， ? 膜蛋白 往往用非離子型表面活性劑的稀溶液抽提。 ? 不溶性蛋白 ，如角蛋白、膠原、絲心蛋白，可以用適當(dāng)?shù)娜軇┫慈タ扇芪铩? 三、抽提 ? 使用類(lèi)似于生理?xiàng)l件下的緩沖液 – 20～ 50mmol/L的磷酸緩沖液 (～ ) – () – 含少量緩沖液的 – 必要時(shí)，可加入 EDTA(1～ 5mmol/L)，巰基乙醇(320mmol/L)或蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑等。 三、抽提 ? 抽提的原則是： 少量多次 。 三、抽提 抽提過(guò)程中需要注意： ? ① 低溫 (0℃ 4℃) 抽提 ； ? ②抽提蛋白水解酶時(shí)，須 加入抑制劑 ； – 如：以 Ser為活性中心的酶，加二異丙基氟磷酸 (DFP)，以巰基為活性中心的酶，加對(duì)氯汞苯甲酸 (PCMB)。 ? ③抽提含有活性巰基的蛋白質(zhì)時(shí)，要 保護(hù)巰基 – 不要帶入金屬離子，可加入金屬螯合劑，如 EDTA； – 不要帶進(jìn)氧化劑，可加入還原劑，如抗壞血酸等； 三、抽提 抽提過(guò)程中需要注意： ? ④抽提帶非共價(jià)鍵結(jié)合的配基的蛋白質(zhì)時(shí)，要 保護(hù)配基 ，不要使其丟失； ? ⑤選擇抽提條件時(shí)應(yīng)考慮，盡量 減少 非蛋白質(zhì) 雜質(zhì) 被同時(shí)抽提出來(lái)； ? ⑥如實(shí)驗(yàn)材料含有大量的脂肪，為了避免它干擾以后的分離提純操作，須用有機(jī)溶劑 (如：丙酮、石油醚 )萃取，以 去除脂肪 。 三、抽提 抽提過(guò)程中需要注意： ? ⑦ 防止 植物組織中的 多酚物質(zhì)，氧化褐變 ，干擾蛋白質(zhì)的分離提純。 ? ⑧對(duì)植物組織使用較高濃度的緩沖液作為抽提液，防止 植物細(xì)胞的 內(nèi)含物改變抽提液的 pH值 。 ? ⑨抽提外周膜蛋白時(shí)，必須用含有 EDTA的適當(dāng)緩沖液；抽提內(nèi)嵌膜蛋白時(shí)，必須用去污劑作增溶劑。 ? ⑩ 可用高速離心法和過(guò)濾法 (添加適當(dāng)?shù)闹鸀V劑 )使粗提液澄清。粗提液中如有大量核酸，可用核酸酶或用魚(yú)精蛋白去除。 第三節(jié) 蛋白質(zhì)的粗分離 ? 根據(jù)蛋白質(zhì)的溶解度差異分離 ? 根據(jù)蛋白質(zhì)分子大小的差異分離 1. 鹽析法 原理 ： 是將硫酸銨、硫酸鈉或氯化鈉等加入蛋白質(zhì)溶液，使蛋白質(zhì)表面電荷被中和以及水化膜被破壞，導(dǎo)致蛋白質(zhì)在水溶液中的穩(wěn)定性因素被去除沉淀。 優(yōu)點(diǎn) ： 沉淀的蛋白質(zhì)保持著它的天然構(gòu)象，能再溶解。 一、根據(jù)蛋白質(zhì)溶解性的差異分離 2. 有機(jī)溶劑分級(jí)分離法 選擇原則： 與水完全混溶 不與蛋白質(zhì)反應(yīng) 有較好的沉淀效應(yīng) 溶劑蒸氣無(wú)毒、不易燃 原理 ： 是將有機(jī)溶劑（丙酮、乙醇 )加入蛋白質(zhì)溶液中，導(dǎo)致溶液介電常數(shù)降低，增加了相反電荷之間的吸引力，蛋白質(zhì)分子表面可解離基的離子化強(qiáng)度減弱，水化程度降低，因此促進(jìn)了蛋白質(zhì)分子的聚集和沉淀。 有機(jī)溶劑 優(yōu)點(diǎn)： 比鹽析法分辨率高，提純效果好，生產(chǎn)中應(yīng)用多。 注意事項(xiàng)： 使用丙酮沉淀時(shí)，必須在 0～ 4℃下進(jìn)行。丙酮用量一般 10倍于蛋白質(zhì)溶液體積。蛋白質(zhì)被 丙酮沉淀后，應(yīng)立即分離，防止變性。 ? 水溶性中性高聚物 – 聚乙二醇（ PEG） ? 聚丙烯酸 —— 堿性蛋白質(zhì) ? 極端條件 – 熱、 pH、有機(jī)溶劑 – 等電點(diǎn)沉淀 – 氯仿 —— 血紅蛋白 ? 免疫沉淀 – 抗原抗體特異結(jié)合形成不溶性復(fù)合物 透析 (dialysis)： 利用透析袋把大分子蛋白質(zhì)與小分子化合物分開(kāi)的方法 。 只用于除鹽類(lèi)和小分子雜質(zhì) 二、根據(jù)蛋白質(zhì)分子大小的差異分離 ： 應(yīng)用正壓或離心力使蛋白質(zhì)溶液透過(guò)有一定截留分子量的超濾膜，達(dá)到濃縮蛋白質(zhì)溶液的目的。 除小分子雜質(zhì)，分離、濃縮蛋白質(zhì) 加壓 蛋白質(zhì)溶液 半透膜 超濾液 支持膜的柵板 滴加樣品 4 % 8 % 12% 16% 20% 塑料離心管 蔗糖密度梯度 （介質(zhì)還可用：氯化銫、甘油等） 蔗糖濃度 % 分子量由小 ————? 大 ： 蛋白質(zhì)顆粒沉降不僅決定于它的大小，也決定于它的密度。若它在具有密度梯度的介質(zhì)中離心時(shí)，質(zhì)量和密度大的顆粒沉降的較快，每種蛋白質(zhì)顆粒沉降到與自身密度相等的介質(zhì)密度時(shí)，即停止不前。 第四節(jié) 蛋白質(zhì)的層析分離 層析技術(shù)也稱(chēng)色譜法 (chromatography)，是 1906年俄國(guó)植物學(xué)家 Michael Tswett發(fā)現(xiàn)并命名的。他將植物葉子的色素通過(guò)裝填有吸附劑的柱子，各種色素以不同的速率流動(dòng)后形成不同的色帶而被分開(kāi)，由此得名為 “ 色譜法 ” 。 后來(lái)無(wú)色物質(zhì)也可利用吸附柱層析分離。 1941年，英國(guó)生物學(xué)家 Martin和 Synge首先提出了色譜塔板理論。 以后層析法不斷發(fā)展，相繼出現(xiàn)氣相層析、高壓液相層析、紙層析、薄層層析、親和層析、凝膠層析等。 一、層析概述 二、離子交換層析 三、凝膠過(guò)濾層析 四、疏水層析 五、親和層析 六、吸附層析 七、聚焦層析 八、高效液相層析 （一）層析的原理 層析技術(shù)是一組相關(guān)分離方法的總稱(chēng)，當(dāng)待分離的混合物隨流動(dòng)相通過(guò)固定相時(shí)，由于各組份的 理化性質(zhì)存在差異 ，與兩相發(fā)生相互作用（ 吸附、溶解、結(jié)合 等）的能力不同，在 兩相