【正文】 用介質(zhì)不結(jié)合的蛋白質(zhì)，在酸性 pH條件下則能夠結(jié)合 ﹡ 洗脫時(shí)，洗脫液 pH逐漸升高。 非特異性洗脫 指通過(guò)改變洗脫緩沖液 pH、離子強(qiáng)度、溫度等條件，降低待分離物質(zhì)與配體的親和力而將待分離物質(zhì)洗脫下來(lái)。 高效液相色譜對(duì)樣品的適用性廣，不受分析對(duì)象揮發(fā)性和熱穩(wěn)定性的限制，因而彌補(bǔ)了氣相色譜法的不足。 ? 特點(diǎn)： ? 靈敏度高； ? 線形范圍高； ? 流通池可做的很小 （ 1mm 10mm ，容積 8μL） ； ? 對(duì)流動(dòng)相的流速和溫度變化不敏感； ? 波長(zhǎng)可選，易于操作； ? 可用于梯度洗脫。 硬膠 主要用于離子交換和尺寸排阻色譜中，它由聚苯乙烯與二乙烯苯基交聯(lián)而成。 特別適合復(fù)雜混合物分離及衡量分析 。 3. 流動(dòng)相選擇 在選擇溶劑時(shí)，溶劑的極性是選擇的重要依據(jù)。 （ 3）高純度 由于高效液相色譜靈敏度高，對(duì)流動(dòng)相溶劑的純度也要求高。其裝置復(fù)雜，價(jià)格昂貴，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，不便于推廣應(yīng)用。天然淀粉經(jīng)加工處理即可使用，但孔徑度可調(diào)性差，并且由于其批號(hào)之間的質(zhì)量相差很大，很難得到重復(fù)的電泳結(jié)果，加之電泳時(shí)間長(zhǎng)，操作麻煩，分辨率低，實(shí)驗(yàn)室中已很少使用。聚丙烯酰胺凝膠具有機(jī)械強(qiáng)度好，有彈性，透明，化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，對(duì) pH和溫度變化小，沒(méi)有吸附和電滲作用小的特點(diǎn)，是一種很好的電泳支持介質(zhì)。在進(jìn)行化學(xué)聚合前，一般用減壓抽氣的辦法除去溶液中溶解的空氣。濃度過(guò)小，凝膠稀軟，不易操作，也易斷裂。 3） 凝膠的 pH不同。 2） 緩沖液離子組成的不連續(xù)性。 凝膠濃度越大，孔徑越小 。 TEMED的存在，可以加速聚合。 電泳受 粒子本身大小、形狀、所帶電量 、溶液粘度、溫度、 pH、電滲及離子強(qiáng)度 多種因素的影響。 ?以上二種類型的電泳，由于介質(zhì)的孔徑度大，沒(méi)有分子篩效應(yīng)，主要靠被分離物的電荷多少進(jìn)行分離。但電泳技術(shù)的廣泛應(yīng)用，則是在 1937年用濾紙作為支持介質(zhì)成功地進(jìn)行紙電泳以后，特別是近幾十年以來(lái)，電泳技術(shù)發(fā)展很快，各種類型的電泳技術(shù)相繼誕生，在生物化學(xué)、醫(yī)學(xué)、免疫學(xué)等領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用。 （ 2）溶劑與檢測(cè)器匹配。 常用溶劑： 己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇 乙腈、水、緩沖液。 2. 全多孔型固定相 由直徑為 10nm的硅膠微粒凝聚而成 。 剛性固體 以二氧化硅為基質(zhì)，可承受?108 ～ ?109Pa的高壓，可制成直徑、形狀、孔隙度不同的顆粒。 ?內(nèi)梯度 : ?一臺(tái)高壓泵 , 通過(guò)比例調(diào)節(jié)閥 ,將兩種或多種不同極性的溶劑按一定的比例抽入高壓泵中混合。 無(wú)化學(xué)鍵引入，只存在相對(duì)較弱的 氫鍵 、 范德華力 和疏水作用力 相互作用。 優(yōu)點(diǎn) ? 提純效率高 ? 分離快速 （二）親和層析用基質(zhì) 具有 較好 的物理化學(xué) 穩(wěn)定性 能夠和 配體穩(wěn)定的結(jié)合 結(jié)構(gòu)為 均勻 的 多孔網(wǎng)狀 結(jié)構(gòu) 與樣品中的各個(gè)組分均 沒(méi)有明顯的非特異性吸附 各類基質(zhì)優(yōu)缺點(diǎn) 優(yōu)點(diǎn) 缺點(diǎn) 纖維素 價(jià)格低、活性基團(tuán)較多 非特異性吸附強(qiáng)、穩(wěn)定性和均一性較差 交聯(lián)葡聚糖 穩(wěn)定性較好 孔徑較小、穩(wěn)定性不好 聚丙烯酰胺 同上 同上 瓊脂糖 非特異性吸附低、穩(wěn)定性好、孔徑均勻適當(dāng)、宜于活化 多孔玻璃 機(jī)械強(qiáng)度好，化學(xué)穩(wěn)定性好 活性基團(tuán)較少、對(duì)蛋白質(zhì)有較強(qiáng)的吸附作用 基質(zhì)的活化 溴化氰活化 環(huán)氧乙烷基活化 指通過(guò)對(duì)基質(zhì)進(jìn)行一定的化學(xué)處理，使基質(zhì)表面上的一些 化學(xué)基團(tuán) 轉(zhuǎn)變?yōu)?易于和特定配體結(jié)合 的活性基團(tuán) 。 隨著鹽濃度的提高，結(jié)合到固定化配基上的蛋白質(zhì)量也相應(yīng)提高 ?？梢杂媚z層析法。 選用 分級(jí)范圍較窄 的凝膠，且中間值 接近于目的蛋白的分子量 凝膠顆粒大小的選擇 優(yōu)點(diǎn) 缺點(diǎn) 小顆粒 分離效果好 流速慢 分離時(shí)間長(zhǎng) 大顆粒 流速快 區(qū)帶擴(kuò)散 洗脫峰平而寬 凝膠柱的制備 用于分組分離 短而粗 L/D值＜ 10 用于分級(jí)分離 L/D值比較大 對(duì)很難分離的組分一般需要 100cm左右長(zhǎng)的層析柱，其直徑在 1～ 5cm范圍內(nèi)，小于 1cm產(chǎn)生 管壁效應(yīng) ，大于 5cm則 稀釋現(xiàn)象 嚴(yán)重 。 3040 5000800000 1000202200 72 5 981(10) 瓊脂糖系列 較常用的是 Pharmacia和 BioRad兩家的產(chǎn)品，前者生產(chǎn)的稱為 Sepharose，后者的產(chǎn)品為 BioGel A。分析性實(shí)驗(yàn) 濃度低 ④ 離子強(qiáng)度 可防止蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間或與凝膠介質(zhì)之間的相互作用 常用鹽溶液： 20100mmol/L NaCl 濃度過(guò)高 引起凝膠柱床體積變化 （二）凝膠過(guò)濾層析的介質(zhì) 葡聚糖系列 瓊脂糖系列 聚丙烯酰胺系列 多孔硅膠 葡聚糖系列 以微生物產(chǎn)生的 葡聚糖 Dextran為原料 用 環(huán)氧氯丙烷為交聯(lián)劑 ，在堿性條件下交聯(lián)而成商品的凝膠，稱為 Sephadex 葡聚糖凝膠 (Sephadex )的物理特性 品 名 干膠顆粒 直徑 /μm 得水值 Wf/ 床體積 / 最適分段分離范圍 溶脹所需 時(shí)間 /h 最大流體 靜力壓 /Pa (cmH2O) 球蛋白分 子質(zhì)量／ Da 線性葡聚糖 分子質(zhì)量 /Da 20℃ lOO ℃ Sephadex G1O 40120 177。即該成分的 Kd＝ 0。 再生 對(duì)使用過(guò)的離子交換劑進(jìn)行處理，使其恢復(fù)原來(lái)性狀的過(guò)程。用交聯(lián)葡聚糖離子交換劑和纖維素離子交換劑時(shí)，常用的柱高為 15～ 20cm。 一般分離蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì) 常用弱酸型或弱堿型離子交換劑 。 DEAEsephadexA50 QAEsephadexA25 弱堿性、陰離子交換劑 QAE+ Cl— 177。 注意：梯度洗脫呈現(xiàn)一個(gè)峰，但有可能存在兩個(gè)性質(zhì)接近的蛋白質(zhì)。 以后層析法不斷發(fā)展，相繼出現(xiàn)氣相層析、高壓液相層析、紙層析、薄層層析、親和層析、凝膠層析等。 ? 水溶性中性高聚物 – 聚乙二醇（ PEG） ? 聚丙烯酸 —— 堿性蛋白質(zhì) ? 極端條件 – 熱、 pH、有機(jī)溶劑 – 等電點(diǎn)沉淀 – 氯仿 —— 血紅蛋白 ? 免疫沉淀 – 抗原抗體特異結(jié)合形成不溶性復(fù)合物 透析 (dialysis)： 利用透析袋把大分子蛋白質(zhì)與小分子化合物分開(kāi)的方法 。粗提液中如有大量核酸，可用核酸酶或用魚(yú)精蛋白去除。 三、抽提 ? 使用類似于生理?xiàng)l件下的緩沖液 – 20～ 50mmol/L的磷酸緩沖液 (～ ) – () – 含少量緩沖液的 – 必要時(shí)，可加入 EDTA(1～ 5mmol/L)，巰基乙醇(320mmol/L)或蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑等。 ? 酵母和細(xì)菌細(xì)胞，可用法蘭西壓榨機(jī)(Frenchpress)、 Manton— Gaulin勻漿器、振動(dòng)研磨機(jī)、超聲波破碎、反復(fù)凍融法。 – (2)少數(shù)蛋白質(zhì)必須在高離子強(qiáng)度的極性介質(zhì)中才能保持活性，可以加 KCI，或 NaCl， (NH4)2SO4。 四、蛋白質(zhì)分離提純的一般程序 ? 第四階段 (質(zhì)量鑒定 )：純度、濃度 – SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳法、等電聚焦法、超離心沉降法、免疫電泳法、酶活力法、蛋白質(zhì)化學(xué)結(jié)構(gòu)分析法等。 – 適合于處理大量的樣品溶液。 – (2)用酶分析法測(cè)定家畜家禽以及農(nóng)作物中某種物質(zhì)的含量，需要用高純度的酶制劑。 四、蛋白質(zhì)分離提純的一般程序 準(zhǔn)備工作： ? 選材，處理； ? 建立適當(dāng)?shù)募?xì)胞破碎和蛋白質(zhì)抽提方法； ? 建立一系列的分離提純和濃縮的方法； ? 建立靈敏而方便的分析方法，以估計(jì)每一個(gè)分離提純步驟的提純倍數(shù)和收率； ? 建立鑒定純度的方法 (如： SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳、等電聚焦等 )，以鑒定蛋白質(zhì)制劑的純度 。 ? 柱層析法對(duì)蛋白質(zhì)的分離提純效果很好，但不能處理大量的樣品溶液 – 制備性聚丙烯酰胺 凝膠電泳 ，或 蔗糖密度梯度等電聚焦法 進(jìn)一步提純。 – 酶需要測(cè)定比活力及酶溶液的蛋白質(zhì)濃度。 四、蛋白質(zhì)分離提純的一般程序 需要額外注意的兩個(gè)問(wèn)題： ? 天然構(gòu)象的保持 ? 多亞基多功能寡聚酶 第二節(jié) 前處理 一、材料的選擇 二、細(xì)胞破碎 三、抽提 第二節(jié) 前處理 一、材料的選擇 ? 選材的原則是： – (1)材料中所需蛋白質(zhì)的含量要高； – (2)材料易得。每一層的相對(duì)含量即表示細(xì)胞破碎程度。 ? ③抽提含有活性巰基的蛋白質(zhì)時(shí)，要 保護(hù)巰基 – 不要帶入金屬離子，可加入金屬螯合劑，如 EDTA； – 不要帶進(jìn)氧化劑，可加入還原劑，如抗壞血酸等； 三、抽提 抽提過(guò)程中需要注意： ? ④抽提帶非共價(jià)鍵結(jié)合的配基的蛋白質(zhì)時(shí)，要 保護(hù)配基 ，不要使其丟失； ? ⑤選擇抽提條件時(shí)應(yīng)考慮，盡量 減少 非蛋白質(zhì) 雜質(zhì) 被同時(shí)抽提出來(lái)； ? ⑥如實(shí)驗(yàn)材料含有大量的脂肪，為了避免它干擾以后的分離提純操作，須用有機(jī)溶劑 (如：丙酮、石油醚 )萃取，以 去除脂肪 。 一、根據(jù)蛋白質(zhì)溶解性的差異分離 2. 有機(jī)溶劑分級(jí)分離法 選擇原則： 與水完全混溶 不與蛋白質(zhì)反應(yīng) 有較好的沉淀效應(yīng) 溶劑蒸氣無(wú)毒、不易燃 原理 ： 是將有機(jī)溶劑（丙酮、乙醇 )加入蛋白質(zhì)溶液中，導(dǎo)致溶液介電常數(shù)降低，增加了相反電荷之間的吸引力，蛋白質(zhì)分子表面可解離基的離子化強(qiáng)度減弱，水化程度降低，因此促進(jìn)了蛋白質(zhì)分子的聚集和沉淀。若它在具有密度梯度的介質(zhì)中離心時(shí)，質(zhì)量和密度大的顆粒沉降的較快，每種蛋白質(zhì)顆粒沉降到與自身密度相等的介質(zhì)密度時(shí)，即停止不前。 （二）層析的分類 按 固定相 基質(zhì)的形式： 柱層析、紙層析和薄層層析 根據(jù)流動(dòng)相的形式： 液相層析、氣相層析 凝膠過(guò)濾 原理 吸附層析 疏水層析 分配層析 親和層析 離子交換 （三）層析前蛋白質(zhì)處理 主要是利用 鹽析法、等電點(diǎn)沉淀、有機(jī)溶劑沉淀 等方法，使目的蛋白與其它較大量的雜蛋白分開(kāi)，這些方法的特點(diǎn)是簡(jiǎn)便、處理量大、既能除去大量雜質(zhì)，又能濃縮蛋白質(zhì)，但分辨率低。 原理：利用 蛋白質(zhì)的電荷 和 層析載體的電荷 間的相互作用 ， 進(jìn)而達(dá)到分離純化的目的 。 SP sephadex C50 優(yōu)點(diǎn)： ?不會(huì)引起被分離物質(zhì)的變性或失活 ?非特異性吸附 ?交換容量大 ?同時(shí)具有分子篩效應(yīng) 離子交換葡聚糖的選用： 一般根據(jù)蛋白質(zhì)的分子量而定 ?中等分子量（ 30000202200）一般選 A50和 C50 ?低分子量（＜ 30000）和高分子量（＞ 202200） 均宜 選用 A25和 C25。 ?水懸浮 去除雜質(zhì)和細(xì)小顆粒 緩沖液的選擇 離子強(qiáng)度和 pH 保證各個(gè)待分離物質(zhì)的穩(wěn)定；使待分離樣品與離子交換劑有較穩(wěn)定的結(jié)合，而盡量使雜質(zhì)不與離子交換劑結(jié)合或結(jié)合不穩(wěn)定； 注意 平衡緩沖液中不能有與離子交換劑結(jié)合力強(qiáng)的離子，否則會(huì)大大降低交換容量，影響分離效果。 上樣量要適當(dāng)，不要超過(guò)柱的負(fù)荷能力，通常上樣量為交換劑交換總量的 1％ 5％ 。 C下 保存。 Kd值介于 0l之間， 物質(zhì)的洗脫速度隨其 Kd值的 增加而降低。 46 10005000 1005000 6 2 9810(100) Sephadex G50 粗 中粗 細(xì) 超細(xì) 100300 50150 2080 1040 177。 先制成丙烯基的衍生物，然后再用 N， N’甲叉雙丙烯酰胺交聯(lián)，得到商品化的凝膠， 產(chǎn)物也是固體粉末，用前先溶漲。 上樣 分組分離 加樣體積約為凝膠柱床體積的 10％～ 25％ 分級(jí)分離 加樣體積約為凝膠柱床體積的 1％～ 5％ 洗脫 水 分離 不帶電荷 的中性物質(zhì) 電解質(zhì)溶液 （酸、堿、鹽的溶液 ） 分離 帶電基團(tuán) 的樣品 水與有機(jī)溶劑的混合液（ 水