活性蛋白質(zhì)的分離與應(yīng)用(編輯修改稿)
2025-06-15 12:19 本頁面
【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 5)成品加工：測(cè)定蛋白質(zhì)的性質(zhì)并干燥成成品。 蛋白質(zhì)分離純化的方法 ? 對(duì)于蛋白質(zhì)分離與純化的方法，可以根據(jù)蛋白質(zhì)的不同性質(zhì)而加以選擇。蛋白質(zhì)的性質(zhì)是指分子大小、溶解度、電荷、吸附性質(zhì)及對(duì)其他分子的生物學(xué)親和力等 。 蛋白質(zhì)分離純化的方法 ? 蛋白質(zhì)分子都是大分子，在提取過程中，與混合物中的其他“雜質(zhì)”相對(duì)分子質(zhì)量相差較大，而且不同的蛋白質(zhì)其大小也不同。根據(jù)這種性質(zhì)而采用的分離方法有： （ 1）透析和超過濾 ： ? 是根據(jù)蛋白質(zhì)分子不能通過半透膜的性質(zhì)使蛋白質(zhì)和其他小分子物質(zhì)（如無機(jī)鹽、單糖等）分開。常用的半透膜是玻璃紙、火棉紙等合成材料。 ? 透析是將待提純的蛋白質(zhì)溶液裝在半透膜的透析袋里放在蒸餾水或流水中，蛋白質(zhì)溶液中的無機(jī)鹽等小分子通過透析袋擴(kuò)散入純水中以除去小分子。 ? 超過濾是利用外加壓力或離心力使水和其他小分子通過半透膜，而蛋白質(zhì)留在膜內(nèi)。 ? 這兩種方法只能將蛋白質(zhì)和小分子物質(zhì)分開，而不能將不同的蛋白質(zhì)分離開。 ? （ 2）密度梯度離心 ： ? 蛋白質(zhì) 顆粒的沉降不僅決定于它的大小，而且也取決于它的密度。如果蛋白質(zhì)顆粒在具有密度梯度的介質(zhì)中離心時(shí)，則質(zhì)量和密度大的顆粒比質(zhì)量和密度小的顆粒沉降得快，而每種蛋白質(zhì)顆粒沉降到與自身密度相等的介質(zhì)梯度時(shí)，即停滯不前，最后各種蛋白質(zhì)在離心管中被分離成各自獨(dú)立的區(qū)帶。分成區(qū)帶的蛋白質(zhì)可以在管底刺小孔逐滴放出，分部收集，然后再對(duì)每個(gè)組分進(jìn)行小樣分析以確定區(qū)帶位置。 ? 常用的密度梯度為蔗糖梯度，在管底的密度最大，向上逐漸減少。密度梯度離心時(shí)對(duì)蛋白質(zhì)有一種穩(wěn)定作用，即可清除由于溫度變化或機(jī)械振動(dòng)引起的區(qū)帶界面的擾亂。 （ 3）凝膠過濾 ： ? 凝膠過濾又稱分子篩層析。這是根據(jù)分子大小分離蛋白質(zhì)混合物有效的方法之一。凝膠過濾是一種柱層析，柱中的填充物是大分子 的惰性聚合物，最常用的有葡聚糖凝膠和瓊脂糖凝膠等。葡聚糖凝膠是具有不同交聯(lián)度的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)物，它的“網(wǎng)孔”大小可以通過控制交聯(lián)劑與葡聚糖的比例來達(dá)到。不同型號(hào)的葡聚糖凝膠裝在層析柱中，不同分子的蛋白質(zhì)混合物借助重力通過層析柱時(shí)，比“網(wǎng)孔”大的蛋白質(zhì)分子不能進(jìn)入凝膠顆粒的網(wǎng)格內(nèi)，而被排阻在凝膠粒之外，隨著洗脫劑通過凝膠粒外圍而流出；比“網(wǎng)孔”小的分子則擴(kuò)散進(jìn)入凝膠粒內(nèi)部，然后再可逆地?cái)U(kuò)散出來通過下層凝膠。這樣，由于不同大小的分子所經(jīng)過路程不同而得以分離，大分子先洗下來，小分子后洗下來。 凝膠過濾層析原理 蛋白質(zhì)分離純化的方法 ? 各種蛋白質(zhì)的溶解度大小在相同的外界條件下，主要取決于它們的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，例如分子中極性的親水基團(tuán)與非極性的疏水基團(tuán)的比例，它們?cè)诘鞍踪|(zhì)分子表面的排布等。因此，根據(jù)各種蛋白質(zhì)的不同溶解度，選擇適當(dāng)?shù)耐獠織l件，即能加以分離。 （ 1）等電點(diǎn) 沉淀法 ? 由于蛋白質(zhì)分子在等電點(diǎn)時(shí)凈電荷為零，減少了分子間的靜電斥力，因而容易聚集而沉淀，此時(shí)溶解度最小。由于不同蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)不同，所以調(diào)節(jié) pH達(dá)到某蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)時(shí)，則該蛋白質(zhì)首先沉淀。這種方法分離出的蛋白質(zhì)保持著天然構(gòu)象，改變 pH又可以重新溶解。 （ 2）鹽溶與 鹽析 ? 中性鹽對(duì)蛋白質(zhì)的溶解度有顯著的影響，這種影響具有雙重性。低濃度的中性鹽可以增加蛋白質(zhì)的溶解度，稱為鹽溶；高濃度的中性鹽則可以降低蛋白質(zhì)的溶解度，使蛋白質(zhì)發(fā)生沉淀，這種由于在蛋白質(zhì)溶液中加入大量中性鹽，使蛋白質(zhì)沉淀析出的作用稱為鹽析。對(duì)于難溶于水的蛋白質(zhì)（如植物球蛋白），由于鹽離
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