蛋白質分分離純化和表征(編輯修改稿)
2025-05-29 13:42 本頁面
【文章內容簡介】 層 用途：制豆腐（加熱 +少量鹽鹵） 四、蛋白質分離純化的一般原則 前處理：細胞破碎 粗分級分離：鹽析 、 等電點沉淀 、 有機溶劑沉淀等 細分級分離：層析 、 電泳 、 結晶 蛋白質純化測總目標：增加 純度或比活力 ? 動物材料剔除結締組織、脂肪組織 。 種子材料應先去殼和種皮以免受單寧等物質的污染 , 油料種子脫脂 . ? 選擇適當方法 ,破碎組織或細胞：動物組織 (電動搗碎機或勻漿器或超聲 )。 ? 植物組織 (英砂或玻璃粉和適當的緩沖液研磨或用 纖維素酶 )。 細菌細胞 (超聲 ,與砂研磨或 溶菌酶 ). ? 選擇適當的緩沖液把所要的蛋白質提取出來 . ? 如果蛋白質是與細胞膜或膜質細胞器結合的 , 用超聲波或去污劑使膜結構解聚 , 用適當的介質提取。 前處理 : 五、蛋白質分離純化的一般方法 ? 根據分子量：如沉降速度法離心 ? 根據密度：沉降平衡法離心 ? 根據電荷和分子量：聚丙烯酰胺凝膠電泳 ? 根據分子量和分子形狀：凝膠過濾 ? 根據溶解度：硫酸銨分級沉淀、有機溶劑分級沉淀 ? 根據電荷：等電點沉淀 透析：利用半透膜的選擇通透性來純化象蛋白質這樣的大分子物質的過程叫透析。 超過濾：是利用壓力或離心力，強行使水和其他小分子而蛋白質分子被截留在膜上，以達到濃縮和脫鹽的目的，有時要用切向流過濾法。 （一）根據分子大小不同的分離純化方法 磁力攪拌器 透析液 裝有蛋白溶液的透析袋 攪拌子 透析 超濾 離心技術主要用于各種生物樣品的分離和制備，生物樣品懸浮液在高速旋轉下，由于巨大的離心力作用，使懸浮的微小顆粒（細胞器、生物大分子的沉淀等）以一定的速度沉降，從而與溶液得以分離，而沉降速度取決于顆粒的質量、大小和密度。 密度梯度離心技術是利用每種蛋白質顆粒沉降到與自身密度相等的密度梯度時即停止不前，最后各種蛋白質在離心管中被分離成各自的區(qū)帶。 常用的密度梯度有蔗糖梯度，聚蔗糖梯度等。 密度梯度（區(qū)帶）離心 常用于生成密度梯度的介質是蔗糖 、 聚蔗糖 （ Ficoll） ， 分離核酸時還常用 CsCl作為介質 。 凝膠過濾法 ? 常用凝膠：交聯葡聚糖 、 聚丙烯酰胺凝膠 ， 瓊脂糖（ sepharose 或 BioGel A） ； ? 凝膠網孔大小一定 ， 只允許相應大小的分子進入凝膠顆粒內部 ， 大分子則被排阻在外 ， 即分 級分離范圍或排阻極限 。 ? 大分子從顆粒間隙流下來 ， 洗脫液體積小 。 小分子在顆粒網狀結構洗脫歷程長 ， 后洗脫下來 ， 洗脫體積大； ? 用洗脫體積同標準分子量的蛋白質的比例關系測定蛋白質分子量； （二）利用溶解度差別的純化方法 影響蛋白質溶解度的外部因素很多 ， 其中主要有：溶液的 pH、 離子強度 、 介電常數和溫度 。 溶解度歸根結底取決于他們本身的分子結構 。 1. 通過改變溶液 pH值的等電點沉淀法 2. 通過改變溶液離子強度的鹽析、鹽溶 3. 有機溶劑的分級沉淀 4. 通過改變溫度的沉淀法 在等電點 pH條件下 ， 蛋白質為電中性 ， 其物理性質如導電性 、 溶解度 、 黏度 、 滲透壓等都表現為最低值 ，易發(fā)生絮結沉淀 。 因此 ， 等電點性質常被用于蛋白質的分離制備 ， 被稱為等電點沉淀技術 。 等電點沉淀 鹽溶與鹽析 ? 鹽溶：一般在低鹽濃度的情況下 ， 蛋白質的溶解度隨鹽濃度的升高而增加 ， 這種現象稱為 鹽溶 ； ? 鹽析 :當鹽濃度升高到一定程度后 ， 蛋白質的溶解度又隨著鹽
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