chapter2蛋白質-3-蛋白質分離技術介紹(編輯修改稿)
2025-02-08 07:51 本頁面
【文章內容簡介】 2．蛋白質的純化方法 ① SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳測定法 SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，也稱為十二烷基酸鈉 聚丙烯酰胺凝膠電泳 (sodium dodecyl sulphatepolyacrylamide gel electrophoresis, SDSPAGE)。主要用于蛋白質亞基分子量的測定。 (1)原理： 在自然狀態(tài)下蛋白質通過二硫鍵聚合形成高度折疊的生物大分子 ，在水溶液中 ， 由于氨基酸殘基的解離作用使蛋白質分子形成帶有一定凈電荷的分子 。 在電場下向自身電荷相反的方向移動 。 b. 還原劑的解聚作用 在蛋白溶液和分離凝膠介質中加入還原劑 — ?巰基乙醇 (? mercaptoethanol)或二硫蘇糖醇 (Dithiothretiol, DTT)。 蛋白質分子在還原劑作用下二硫鍵被還原 ， 將多聚體或單鏈折疊的蛋白質分子的二硫鍵打開 ， 形成長短不一的單鏈亞基 。 c. SDS的包裹作用 SDS分子中含有大量的帶負電的磺酸基 。 蛋白質分子解聚后形成的氨基酸側鏈與 SDS結合 ， 在 SDS的重量達到蛋白重量的 34倍時蛋白質分子表面完全被 SDS包裹 ， 形成 帶負電荷的蛋白質亞基分子 ，稱之為蛋白質 SDS復合物 ( proteinSDS micelles)。 由于蛋白質 SDS復合物所帶負電荷遠大于蛋白質分子自身有的凈電荷 ， 這樣就消除了不同分子之間原有的電荷差異 。 d. 聚丙烯酰胺凝膠分子篩作用 不同濃度的凝膠和交聯(lián)度，形成不同大小的網狀結構，它對蛋白質 SDS復合物具有阻滯作用。在電場下， 分子量大的亞基受阻大，電泳速度慢，走在小分子的后面； 分子量小的亞基受阻小，電泳速度快， 走在大分子的前面。不同分子量的亞基受阻程度不同，表現(xiàn)出不同的電泳速度，這樣就把同一樣品中不同大小分子量的亞基分開。 (2) 操作過程 制膠 ? 加樣 ? 電泳 ? 固定 ? 染色 ? 脫色 ? 計算 (3) 結果處理 a. 電泳圖譜 1 2 3 繪制標準曲線：以標準蛋白質分子量的對數 log
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