蛋白質(zhì)的分離純化(1)(編輯修改稿)
2025-05-29 13:42 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 蛋白質(zhì)的形狀近似于長的橢圓棒，全部帶上了大量的負(fù)電荷。 ? 電泳時(shí) SDS蛋白質(zhì)復(fù)合物在凝膠中的遷移率不再受蛋白質(zhì)原有電荷和形狀的影響（全部由負(fù)極向正極移動(dòng)），而主要取決于蛋白質(zhì)分子量。 濃縮膠 分離膠 樣品 SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳裝置 點(diǎn)樣 濃縮膠 分離膠 樣品 SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳裝置 ① 泛指高效毛細(xì)管電泳 、 毛細(xì)管區(qū)帶電泳 、 自由溶液毛細(xì)管電泳和毛細(xì)管電泳 。 ② 用途： 分離多種生物分子 ， 包括氨基酸 、 肽 、 蛋白質(zhì) 、 DNA片段 （ 例如合成的寡核苷酸 ） 和核酸以及多種小分子 ， 如藥物 、甚至金屬離子 。 用樣量 5～ 30μl 1mg/ml溶液 。 ? 等電聚焦或稱電聚焦 ， 是一種高分辨率的蛋白質(zhì)分離技術(shù) ， 它也可用于 蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的測定 。 ? 蛋白質(zhì)混合物是在具有 pH梯度的介質(zhì) （ 如濃蔗糖溶液 ） 中進(jìn)行電泳的 。 在外電場作用下各種蛋白質(zhì)將移向并聚焦 （ 停留 ） 在等于其等電點(diǎn)的 pH梯度處 ， 并形成一個(gè)很窄的區(qū)帶 。 ? 等電聚焦可以把人的血清分成 40多個(gè)條帶 。 此技術(shù)特別適用于同功酶的鑒定 。 只要它們的 pI有 （ 甚至 ） pH單位的差別就能分開 。 ? 實(shí)際上是利用緩沖液在電場作用下在凝膠內(nèi)沿電場方向制造一個(gè) pH梯度 。所用的緩沖液是低分子量的有機(jī)酸和堿的混合物，該混合物稱之兩性電解質(zhì)。 等電聚焦電泳裝置 ? 當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)樣品在這樣的凝膠上電泳時(shí)，每種蛋白質(zhì)都將遷移至與它的 pI 相一致的 pH處， 具有不同 pI的各種蛋白質(zhì)最后都遷移至凝膠中相應(yīng)的 pH處， 達(dá)到分離的目的。 （ twodimensional electrophoresis） ? 將 等電聚焦電泳 與 SDSPAGE結(jié)合起來的電泳技術(shù)。 電泳方向 電泳方向 等電聚焦電泳 SDSPAGE ? 雙向電泳后的凝膠經(jīng)染色蛋白呈現(xiàn)二維分布圖， 水平方向反映出蛋白在 pI上的差異 ，而 垂直方向反映出它們?cè)诜肿恿可系牟顒e 。 ? 所以 雙向電泳可以將分子量相同而等電點(diǎn)不同的蛋白質(zhì)以及等電點(diǎn)相同而分子量不同的蛋白質(zhì)分開。 ?是根據(jù)蛋白質(zhì)的 等電點(diǎn)差異分離 蛋白質(zhì)混合物的柱層析方法。 特種多緩沖交換劑 PH 降低 混和蛋白質(zhì)樣品 特種多緩沖液 特種多緩沖液 收集 特種多緩沖液 收集 特種多緩沖液 依次收集不同的蛋白組分 (P310) ? 填充到層析柱中的樹脂有陽離子交換型和陰離子交換型。 支持介質(zhì)： 對(duì)蛋白質(zhì)交換容量大 陽離子交換劑 陰離子交換劑 CM— 纖維素 (弱酸型 ) P纖維素 (中強(qiáng)酸型 ) SE 纖維素 (強(qiáng)酸型 ) SPSephadex(強(qiáng)酸型 ) AM— 纖維素 (弱堿型 ) PAB纖維素 (弱堿型 ) DEAE纖維素 (中強(qiáng)堿型 ) DEAESephadex(中強(qiáng)堿型 ) TEAE纖維素 (強(qiáng)堿型 ) QAESephadex(強(qiáng)堿型 ) (P310) 以陽離子交換型樹脂為例 ? 將帶有耐酸性非常強(qiáng)的磺酸根 SO3Na＋ （以鹽的形式出現(xiàn)）的 強(qiáng)陽離子交換樹脂（ 固定相 ）填充到層析柱 中。 ? 將含有樣品的 流動(dòng)相 加入層析柱中， 樣品中帶有正電荷的蛋白質(zhì) X， 通過靜電吸引，與樹脂中的帶電基團(tuán)相互作用，結(jié)果 X與 Na＋ 交換（陽離子交換）， 形成 SO3X，蛋白質(zhì)就結(jié)合到了層析柱上 。 ? 在樣品與樹脂充分交換后，可通過 提高流動(dòng)相中的鹽濃度，或改變流動(dòng)相的 pH，或是同時(shí)采用這兩種方法 ，就可以將結(jié)合于樹脂上的蛋白質(zhì) X成分，按照它們與樹脂結(jié)合的強(qiáng)弱程度不同逐一地 洗脫 下來。 結(jié)合到層析柱上的蛋白質(zhì)的洗脫有不同的洗脫方式： 洗脫方式 恒定濃度洗脫 改變鹽濃度或 pH洗脫 跳躍式分段洗脫 漸進(jìn)式連續(xù)改變(梯度洗脫 ) 簡單型混合器 復(fù)合型混合器 ? 利用待純化的分子和雜質(zhì)分子與 吸附劑 之間的吸附能力和解吸性質(zhì)不同而達(dá)到分離目的 。 ? 典型的吸附劑： 硅膠 ,氧化鋁和活性炭等 . 主要用來分離非離子 、 水不溶性化合物 （四） 利用選擇性吸附的純化方法 (P312) 親和層析 (affinity chromatography)： 是利用蛋白質(zhì)分子對(duì)其配體分子特有的識(shí)別能力 , 即生物學(xué)親和力，建立起來的一種有效的純化方法。 經(jīng)常只需一步處理即可將某種所需蛋白質(zhì)從復(fù)雜混合物中分離出來，純度相當(dāng)高。 (五 ) 利用與配體的特異生物學(xué)親和力的純化方法 (P313) 親和層
教學(xué)課件相關(guān)推薦
鄂ICP備17016276號(hào)-1