蛋白質(zhì)和多肽的氨基酸序列測定(編輯修改稿)
2025-05-29 13:42 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 學(xué)過程，在其耦聯(lián)、裂解、轉(zhuǎn)化等步驟都有可 能發(fā)生一些副反應(yīng)，從而影響最終裂解效率。目前最佳產(chǎn)率為 95％～ 98 ％。因此，經(jīng)過 50次循環(huán)后， PTH— 氨基酸分析譜中將出現(xiàn)較多雜峰， 影響正確辨認(rèn)，也就是說對于一般蛋白質(zhì)最多能分析至 N端第 50個氨基 酸左右，欲知全順序，則需將蛋白質(zhì)降解成一系列肽段分析后再拼接。 ① 對于有些蛋白質(zhì)由于含有較多的對 Edman反應(yīng)敏感的殘基或肽鍵，裂 解效率將更低。 ② 循環(huán)至 Ser和 Thr時產(chǎn)率突然降低，這是因為在進(jìn)行這兩個氨基酸殘基 分析前一個循環(huán)中，三氟乙酸除起裂解作用外，可能與 Ser和 Thr上的羥 基反應(yīng)，繼而部分封閉 Ser和 Thr的 N端 — 氨基。 ③ 另外，絲氨酸和蘇氨酸的 PTI{{汀生物也會部分轉(zhuǎn)化成其他產(chǎn)物，造 成產(chǎn)率的降低。 耦聯(lián)試劑 PITC本身也將發(fā)生下列副反應(yīng)，形成一些“雜質(zhì)”。測序完成 后，電腦將每個循環(huán)的產(chǎn)率處理，得出起始產(chǎn)率 (initial yield)和重復(fù)產(chǎn) 率 (repetitive yield)，其中通過起始產(chǎn)率可以估計蛋白質(zhì)的真實含量， 有時可以推測 N端是否封閉 (和氨基酸組成分析測得的含量相差甚遠(yuǎn) )，而 重復(fù)產(chǎn)率則表明機(jī)器是否正常運轉(zhuǎn)。另外，如果蛋白質(zhì)或多肽中含有 過多的 Ser、 Thr、 Glu、 Trp等氨基酸殘基，也將降低這兩個數(shù)值。 第六節(jié) C端序列分析 雖然建立在 Edman化學(xué)法上的自動化 N端測序技術(shù)日趨成熟，但仍 有不少問題需借助 C端序列分析來解決。 C端測序尤其適合于基因重組蛋 白是否正確表達(dá)的鑒定和大規(guī)模生產(chǎn)時的質(zhì)量控制、 N端封閉蛋白的分 析以及 DNA探針的設(shè)計。 由于選擇性對 C端羧基進(jìn)行耦聯(lián)修飾并從 C端逐一將氨基酸殘基切下 較 N端測序困難，在過去的近 20年里，雖然為數(shù)不少的蛋白質(zhì)化學(xué)家致 力于 C端測序研究，但目前仍不能和 N端測序技術(shù)程度媲美。蛋白質(zhì)化學(xué) 工作者曾利用羧肽酶分析 C端氨基酸殘基，但是由于不同的羧肽酶對個 別氨基酸殘基有選擇性，使用時仍有一定困難。 最近，由于對化學(xué)法測定 C
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