第十章蛋白質(zhì)和氨基酸的測定(編輯修改稿)
2024-08-28 13:32 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 g anic pounds ) 凱氏定氮法原理（方程式） 凱氏定氮法注意事項(xiàng) 圖：常量凱氏定氮消化及蒸餾裝置 a． 消化裝置 b． 蒸餾吸收裝置 硫酸鉀 及硫酸銅的作用 火候控制 裝置的氣密性 何時(shí)加堿 難消化的 對策 停止蒸餾 說明及注意事項(xiàng) 0: 當(dāng)濃硫酸的用量為 30ml時(shí) ， 硫酸銅 ， 硫酸鉀 ， 氫氧化鈉等試劑 應(yīng)按比例增加 。 ① 所用試劑溶液應(yīng)用無氨蒸餾水配制 。 ② 消化時(shí)不要用強(qiáng)火 ， 應(yīng)保持和緩沸騰 ， 以免粘附在凱氏瓶內(nèi)壁上的含氮化合物 未消化完全而造成氮損失 。 ③ 消化過程中應(yīng)注意不時(shí)轉(zhuǎn)動(dòng)凱氏燒瓶 ， 以便利用冷凝酸液將附在瓶壁上的固體殘?jiān)聪虏⒋龠M(jìn)其消化完全 。 ④ 樣品中若 含脂肪或糖較多時(shí) ， 消化過程中易產(chǎn)生大量泡沫 ， 為防止泡沫溢 出瓶外 ，在開始消化時(shí)應(yīng)用小火加熱 ， 并不停地?fù)u動(dòng)；或者加入少量辛醇或液體石蠟或硅油消泡劑， 并同時(shí)注意控制熱源強(qiáng)度 。 ⑤ 當(dāng)樣品消化液不易澄清透明時(shí) ， 可將凱氏燒瓶冷卻 ， 加入 30%過氧化氫 2～ 3mL后再繼續(xù)加熱消化 。 ⑥ 若取樣量較大 ， 如干試樣超過 5g， 可按每克試樣 5mL的比例增加硫酸用量 （ 何時(shí)會(huì)必要 ？ ） 。 ⑦ 一般消化至呈透明后 ， 繼續(xù)消化 30min即可 ， 但對于含有特別難以氨化的氮化合物的樣品 ， 如含賴氨酸 、 組氨酸 、 色氨酸 、 酪氨酸或脯氨酸等時(shí) ， 需適當(dāng)延長消化時(shí)間 。 有機(jī)物如分解完全 ， 消化液呈藍(lán)色或淺綠色 ， 但含鐵量多時(shí) ， 呈較深綠色 。 ⑧ 蒸餾裝置不能漏氣 。 ⑨ 蒸餾前若加堿量不足 ， 消化液呈藍(lán)色不生成氫氧化銅沉淀 ， 此時(shí)需再增加氫氧化鈉用量 。 ⑩ 硼酸吸收液的溫度不應(yīng)超過 40℃ ， 否則對氨的吸收作用減弱而造成損失 ， 此時(shí)可置于 冷水浴中使 用 。 11蒸餾完畢后 ， 應(yīng)先將冷凝管下端提離液面清洗管口 ， 再蒸 1min后關(guān)掉熱源 ， 否則可能 造成吸收液倒吸 。 (12)混合指示劑 在堿性溶液中呈綠色，在中性溶液中呈灰色，在酸性溶液中呈紅色。 氨 基酸的分析 ? 什 么 是 氨 基酸 ? ? 氨 基酸的分 類 ? 氨 基酸的化 學(xué)結(jié)構(gòu) ? ? 氨 基酸的 兩 性 電 解 質(zhì) 的特性 氨基酸的結(jié)構(gòu) 氨氨基酸的一般顯色反應(yīng) 茚三酮法 、 吲哚醌法和鄰苯二甲醛法 。 前二種是經(jīng)典的常用顯色法 ， 后一種是近年來發(fā)展起來的熒光顯色法 ， 具有靈敏度高的特點(diǎn) 。 1. 茚三酮法 原理 : 氨基酸或蛋白質(zhì)能與茚三酮作用 ， 生成藍(lán)紫色化合物 . ① 步驟： 將點(diǎn)有樣品的層析濾紙充分除盡溶劑 ， 用 5g/L茚三酮無水丙酮溶液噴霧 ， 充分吹干 ， 65℃ ,30min（ 空氣中的氨可使背景泛紅色 ） ， 氨基酸斑點(diǎn)呈紫紅色 。 為了使各種氨基酸呈現(xiàn)不同顏色 ， 可用下列方法： ② 用 ， 10g酚和 90g正丁醇的混合液顯色 。 ③ 用 1g/L茚三酮無水丙酮溶液顯色完畢后 ， 再用鹽酸蒸汽熏 1min (HOW ?)。 為了使顯色穩(wěn)定 ， 可用下列方法： (何謂貯存液及工作液 ?) 貯存液 A：醋酸鎘 2g、 冰醋酸 40mL、 蒸餾水 200mL 貯存液 B：茚三酮 2g、 丙酮 200mL 顯色液： A/B=:1 (按需制備 ) 點(diǎn)有樣品的濾紙上 浸有 此顯色液后 ， 放置于盛有一小杯 濃硫酸 的密閉玻璃容器中25℃ ， 18h， 或較高溫度下適當(dāng)縮短時(shí)間 。 背景色淺 ， 氨基酸斑點(diǎn)也比較穩(wěn)定 。 拍照記錄 ! 2．吲哚醌法 各種氨基酸與吲哚醌試劑能顯示不同顏色， 因此可借此辯認(rèn)氨基酸。 氨對吲哚醌顯色沒有妨礙，但其靈敏度較茚三酮法稍差 ，顯色不穩(wěn)定，顏色只有在絕對干燥的環(huán)境中才能保存。 3．鄰苯二甲醛法 鄰苯二甲醛在 2巰基乙醇存在下，在堿性溶液中與氨基酸作用產(chǎn)生熒光化合物，最適的激發(fā)光和發(fā)射光波長分別為 340nm和 455nm。在手提式紫外燈 (254/365)下觀察 . * 鄰苯二甲醛法是目前紙上層析、硅膠薄層層析熒光顯色氨基酸最靈敏的方法之一，也可用于氨基酸溶液定量 .氨基酸紙上層析靈敏度達(dá) moL，在硅膠薄層層析上為 ～ moL (不嚴(yán)密 ,因?yàn)楦鞣N氨基酸顯現(xiàn)的熒光強(qiáng)度不同 ,所以因指明是什么 AA.) * 各種氨基酸顯現(xiàn)的熒光強(qiáng)度不同，其相對熒光強(qiáng)度由大到小大致順序如下：天門冬氨酸，異亮氨酸，甲硫氨酸，精氨酸，組氨酸，亮氨酸，絲氨酸，纈氨酸，谷氨酸，蘇氨酸，甘氨酸，色氨酸，丙氨酸，苯丙氨酸，賴氨酸，酪氨酸， NH3，脯氨酸和半胱氨酸。 說明 在濾紙上顯現(xiàn)氨基酸時(shí)，鄰苯二甲醛濃度以 %為宜。 顯色時(shí)必須有一定的濕度，以便氨基酸溶解， 提高分子碰撞機(jī)率，并使極性基團(tuán)解離，促進(jìn)反應(yīng)趨于完全。濕度太低，顯不出熒光。溫度對顯現(xiàn)的熒光延時(shí)有顯著影響，溫度高熒光延時(shí)短，溫度低熒光延時(shí)長。 個(gè)別氨基酸的顯色反應(yīng) 利用個(gè)別氨基酸與某些試劑具有特殊的顯色反應(yīng)定性氨基酸可應(yīng)用于紙層析和紙電泳顯色。 精氨酸，胱氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、脯氨酸、絲氨酸和羥賴氨酸、羥脯氨酸 ,色氨酸、酪氨酸、酪氨酸、組氨酸。 氨基酸定量 一、氨基酸的一般定量測定 （ 一 ） 甲醛滴定法 氨基酸具有酸性的 COOH基和堿性的 NH2基 。 它們相互作用而使氨基酸成為中性的內(nèi)鹽 。 當(dāng)加入甲醛溶液時(shí) ， NH2基與甲醛結(jié)合 ， 從而使其堿性消失 。 這樣就可以用標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)堿溶液來滴定 COOH基 ， 并用間接的方法測定氨基酸總量 。 反應(yīng)式如下： 3． 操作方法 吸取含氨基酸約 20mg的樣品溶液于 100mL容量瓶中 ， 加水至標(biāo)線 ， 混勻后吸取 于 200mL燒杯中 ， 加水 60mL， 開動(dòng)磁力攪拌器 ， 用 計(jì)指示 ， 記錄消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液 mL數(shù) ， 供計(jì)算總酸含量 。
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