【文章內(nèi)容簡介】 g out）。 大量中性鹽的加入使水的活度降低，原來溶液中的大部分甚至全部的自由水轉(zhuǎn)變?yōu)辂}離子的水化水。導(dǎo)致蛋白質(zhì)表面的疏水基團(tuán)的暴露 鹽析 （（ NH4） 2SO4 、 Na2SO4 ） 3．有機(jī)溶劑分級分離法 與水互溶的有機(jī)溶劑 (如甲醇、乙醇和丙酮等 )能使蛋白質(zhì)在水中的溶解度顯著降低。在室溫下，這些有機(jī)溶劑不僅能引起蛋白質(zhì)沉淀，而且伴隨著變性。 有機(jī)溶劑分級分離的 機(jī)理 ? 有機(jī)溶劑引起蛋白質(zhì)沉淀的主要原因之一是 改變了介質(zhì)的介電常數(shù) 。水是高介電常數(shù)物質(zhì) (20℃ 時，80)，有機(jī)溶劑是低介電常數(shù)物質(zhì) (20℃ 時，甲醇 33，乙醇 24，丙酮 )， 因此有機(jī)溶劑的加入使水溶液的介電常數(shù)降低。這樣，蛋白質(zhì)分子表面可解離基團(tuán)的離子化程度減弱，水化程度降低，因此促進(jìn)了蛋白質(zhì)分子的聚集和沉淀。 ? 有機(jī)溶劑引起蛋白質(zhì)沉淀的另一重要方式可能 與 鹽析相似，與蛋白質(zhì)直接爭奪水化水，致使蛋白質(zhì)聚集而沉淀。 4．溫度對蛋白質(zhì)溶解度的影響 ? 在一定溫度范圍內(nèi)，約 0～ 40℃ 之間，大部分球狀蛋白質(zhì)的溶解度隨溫度升高而增加， ? 在 40～ 50℃ 以上，大部分蛋白質(zhì)變得不穩(wěn)定并開始變性，一般在中性 pH介質(zhì)中即失去溶解能力。 ? 大多數(shù)蛋白質(zhì)在低溫下比較穩(wěn)定，因此蛋白質(zhì)的分級分離操作一般都在 0℃ 或更低的溫度下進(jìn)行。 三、根據(jù)電荷不同的純化方法 ? 根據(jù)蛋白質(zhì)的電荷不同即酸堿性質(zhì)不同分離蛋白質(zhì)混合物的方法有 電泳 和 離子交換層析 兩類 ?一 . 電泳 (electrophoresis) ? 在外電場的作用下，帶電顆粒，向著與其電性相反的電極移動，這種現(xiàn)象稱為電泳。 ? 蛋白質(zhì) 電泳 分離原理 ： 分子大小不同的蛋白質(zhì)所帶電種類不同，凈電荷密度不同，遷移率不同，因此，在電泳時可以分開。 電泳的類型 目前電泳的類型很多， 最常見的是區(qū)帶電泳 ，由于在支持物上電泳時蛋白質(zhì)混合物被分離成若干區(qū)帶而得名。 ? 區(qū)帶電泳按其支持物的物理性狀不同可以分成 4類： ? ① 濾紙電泳和薄膜電泳 (如醋酸纖維薄膜電泳和聚酰胺薄膜電泳 )； ? ② 粉末電泳， 支持介質(zhì)是淀粉、纖維素粉或硅膠粉等，粉末與適當(dāng)?shù)娜軇┱{(diào)和，鋪設(shè)成平板； ? ③ 細(xì)絲電泳， 如尼龍絲和其他人造絲電泳，這是一類微量電泳； ? ④ 凝膠電泳， 最常用的支持介質(zhì)有 聚丙烯酰胺 和 瓊脂糖凝膠 ，前者適于分離蛋白質(zhì)和多核苷酸，后者適于分離核酸，這兩種凝膠電泳的分辨率都很高， + + — 聚丙烯酰胺凝膠電泳 (polyacrylaminde gel electrophoresis，簡稱 PAGE) ? 也稱圓盤電泳，它是在區(qū)帶電泳的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的。它以聚丙烯酰胺凝膠為支持物 ,一般 制作成凝 膠柱或凝膠板， 垂直板電泳的優(yōu)越性： ① 表面積大而薄 ， 便于通冷卻水以降低熱效應(yīng) ， 條帶更清晰； ② 在同一塊膠板上 ， 可同時進(jìn)行 10個以上樣品的 電泳 ， 便于在同一條件下比較分析鑒定 ， 還可 用于印跡轉(zhuǎn)移電泳及放射自顯影； ③ 膠板制作方便 ， 易剝離 ， 樣品用量少 ， 分辨率 高 ， 不僅可用于分析 ， 可用于制備； ④ 膠板薄而透明 ， 電泳染色后可制成干板 ， 便于 長期保存與掃描； ⑤ 可進(jìn)行雙向電泳 。 按其凝膠的組成系統(tǒng)可分成四種： (1) 連續(xù)凝膠電泳： 只用一層凝膠 ， 采用相同的 pH值和相同的緩沖液 。 (2) 不連續(xù)凝膠電泳： 采用二層或三層性質(zhì)不同的凝膠 (即：樣品膠 、 濃縮膠和分離膠 )重疊起來 ，使用兩種不同的 pH值 （ ） 和不同的緩沖液 （ TrisHCl和 TrisGly） (3) 孔梯度凝膠電泳 ：采用梯度混合裝置 ， 使制得的凝膠由上至下孔徑逐漸減小 (即凝膠濃度由上至下逐漸增高 )。 梯度凝膠電泳主要適宜于測定球蛋白的相對分子質(zhì)量 。 (4) SDS—凝膠電泳： 在聚丙烯酰胺凝膠中加入 SDS(十二烷基硫酸鈉 ) (5) 等電聚焦 凝膠電泳： (IEFPAGE) 在電泳支持介質(zhì)中加入 載體兩性電解質(zhì) (carrier ampholytes)，通以直流電后在正負(fù)極之間形成穩(wěn)定、連續(xù)和線性的 pH梯度，蛋白質(zhì)在 pH梯度凝膠中受電場力作用下泳動，它的分離僅僅決定于其本身的等電點(diǎn)。 凝膠聚合的原理及有關(guān)特性 1． 聚合反應(yīng) 凝膠的聚合 單體 :丙烯酰胺 (Acr)和交聯(lián)劑甲叉雙丙烯酰胺 (Bis)； 常用過硫酸銨 (AP)為催化劑 ，四甲基乙二胺 (TEMED)為加速劑 。 TEMED的堿基可催化 AP水溶液產(chǎn)生游離氧原子 ， 激活 Acr單體 ， 使其聚合成單體長鏈 ， 在 Bis作用下 ， 聚合成網(wǎng)狀凝膠 （ 化學(xué)聚合 ） 。 堿性條件下凝膠易聚合， 室溫下 ％ 的凝膠在 30min聚合 ， 在 90min。 此外 ， 核黃素亦可為催化劑 ， 聚合需光照 （ 光聚合 ） ， 故使用不多 。 凝膠的孔徑隨著 Acr 的濃度的變化而變化，也跟 Bis的濃度有關(guān) T％ = (a+b)/m l00％ c％ = b/(a+b) 100％ 式中 a： Acr克數(shù)； b： Bis克數(shù)； m：緩沖液體積 (ml)。 T： Acr和 Bis總濃度 c：交聯(lián)劑百分比 再按要求配制不同濃度的凝膠。 注意點(diǎn)： Acr Bis貯液在自然光、 Υ 射線、超聲波的引發(fā)下會發(fā)生聚合，故應(yīng)放在 棕色瓶中避光保存 。 30%的貯液 4℃ 下只能保存一個月。 Acr、 Bis均為 神經(jīng)毒性 ，勿觸及皮膚和粘膜。 過硫酸銨應(yīng)現(xiàn)配現(xiàn)用。 定溶至 100毫升得 T=30% C=%的 貯液 Acr Bis 凝膠濃度與被分離物相對分子質(zhì)量的關(guān)系 T％ 凝膠的孔徑與樣品的 遷移率 有關(guān) A B T% 遷移率 分子量： A〈 B 電荷： A〈 B 遷移率隨著凝膠濃度的變化 而變化 單一條帶不能說明是一種組分 連續(xù)系統(tǒng)： 電泳體系中緩沖液 、 pH值及凝膠濃度相同 ， 即只有 分離膠 。 帶電顆粒在電場作用下 ， 主要靠 電荷效應(yīng) 和 分子篩效應(yīng) ，無濃縮效應(yīng) 。 連續(xù)凝膠系統(tǒng)和不連續(xù)凝膠系統(tǒng) 不連續(xù)系統(tǒng) ： 一般常用二層或三層。由上而下分為： 樣品膠 濃縮膠 分離膠 電泳體系中各層膠中緩沖液離子成分、pH、凝膠濃度及電位梯度都不同。 樣品膠： T=3％ ， c=％ ， 緩沖液為 TrisHCl， 其作用是防止對流 ，促使樣品濃縮以免被電極緩沖溶稀釋 。 目前 ， 一般不用樣品膠 ， 直接將樣品加入蔗糖或甘油后加在濃縮膠的表面 ， 同樣具有防止對流及樣品被稀釋的作用 。 濃縮膠： T=5％ ， c=％ 的大孔膠 ， 緩沖液為 TrisHCl (三羥甲基氨基甲烷 )，其作用是使樣品進(jìn)入分離膠前 ， 被濃縮成窄的區(qū)帶 ， 從而提高分離效果 。 濃縮效應(yīng) 分離膠 ： T=％ 一 20%， c=％ 的小孔膠 ， 緩沖液為 TrisHCl， 大部分蛋白質(zhì)在此 pH條件下帶負(fù)電荷 ， 樣品在該層被分離 。 電荷效應(yīng) 和 分子篩效應(yīng) ， 不連續(xù) PAGE電泳的 3種物理效應(yīng) ： ① 樣品的 濃 縮 效應(yīng)； ② 凝膠對被分離分子的 篩選 效應(yīng) (顆粒小的移動快，顆粒大的移動慢 )； ③ 一般電泳分離的 電荷 效應(yīng)。 由于這 3種物理效應(yīng)，使樣品分離效果好，分辨率高。人血清用紙電泳只能分成 5～7個組分，而圓盤電泳則可分成幾十個清晰的條帶。 ① 樣品濃縮效應(yīng) (由三種不連續(xù)性造成 ) （ 1） 凝膠孔徑的不連續(xù)性 上述三層凝膠中 ， 樣品膠及濃縮膠為大孔膠；分離膠為小孔膠 。 在電場作用下 ， 樣品顆粒在大孔膠中泳動的阻力小 ， 移動速度快；當(dāng)進(jìn)入小孔膠時 ， 受到的阻力大 ， 移動速度減慢 。 因