蛋白質(zhì)分分離純化和表征-資料下載頁
2025-05-02 13:42本頁面
【正文】 imension Isoelectric focusing Isoelectric focusing gel is placed on SDS polyacrylamide gel. Second dimension SDSpolyacrylamide gel electrophoresis 雙向電泳 (Twodimensional electrophoresis) 此法是利用離子交換樹脂作為柱層析支持物，將帶有不同電荷的蛋白質(zhì)進(jìn)行分離的方法。 若選擇陽離子交換樹脂，則帶正電荷的物質(zhì)與 H+發(fā)生交換而結(jié)合在樹脂上。 若選擇陰離子交換樹脂，則帶負(fù)電荷的物質(zhì)可與 OH發(fā)生交換而結(jié)合在樹脂上。 物質(zhì)在樹脂上結(jié)合的牢固程度即親和力大小有差異，因此選用適當(dāng)?shù)南疵撘罕憧蓪⒒旌衔镏械慕M分逐個(gè)洗脫下來，達(dá)到分離純化的目的。 離子交換層析 陽離子交換劑： CM纖維素： OCH2COOH P纖維素：磷酸基 陰離子交換劑： DEAE纖維素：二乙基氨基乙基 AE纖維素：氨基乙基 親和層析 利用化學(xué)方法將可與待分離物質(zhì)可逆性特異結(jié)合的化合物（稱配體）連接到某種固相載體上，并將載有配體的固相載體裝柱，當(dāng)待提純的生物大分子通過此層析柱時(shí)，此生物大分子便與載體上的配體特異的結(jié)合而留在柱上，其他物質(zhì)則被沖洗出去。然后再用適當(dāng)方法使這種生物大分子從配體上分離并洗脫下來，從而達(dá)到分離提純的目的 。 ? 抗原和抗體 ? 激素和受體蛋白 ? 凝集素和糖蛋白 配體 蛋白質(zhì) 蛋白質(zhì)和配體復(fù)合物 交聯(lián)試劑 載體 配體 載體與配體 交聯(lián)體 雜質(zhì) 雜質(zhì) 游離配體 六、蛋白質(zhì)的含量測定與純度 ? 測定蛋白質(zhì)的量是研究蛋白質(zhì)的最基本的一步。 ? 溶液中蛋白質(zhì)的濃度測定方法很多，最早的經(jīng)典方法是凱氏定氮法，稍后應(yīng)用較廣泛的方法是雙縮脲法、福林－酚法和紫外吸收法，近年來大多數(shù)人用考馬斯亮藍(lán)法。 （一）蛋白質(zhì)的含量測定 1. 雙縮脲法 ? 雙縮脲法是基于蛋白質(zhì)分子中的肽鍵，凡具兩個(gè)以上肽鍵的物質(zhì)均會(huì)發(fā)生雙縮脲反應(yīng)。 ? 在堿性溶液中蛋白質(zhì)可以與 Gu2＋ 形成紫紅色絡(luò)合物，其顏色的深淺與蛋白質(zhì)的濃度成正比，而與蛋白質(zhì)的分子量和氨基酸組成無關(guān) 。 2. 福林－酚法 ? 福林－酚法主要基于蛋白質(zhì)在堿性溶液中能與銅形成復(fù)合物 ， 此復(fù)合物以及芳香族氛基酸殘基可以還原酚試劑而產(chǎn)生藍(lán)色 ， 再與標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì) (通常采用牛血清白蛋內(nèi) )比色定量 。 ? 福林 — 酚試劑法靈敏度高 ， 但是如果樣品和標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的芳香族氨基酸差異較大時(shí) ， 會(huì)有較大的系統(tǒng)誤差 。 3. 紫外吸收法 蛋白質(zhì)組成中常含有酪氨酸等芳香族氨基酸 ， 在紫外光 280nm波長處有最大吸收峰 ， 故可用 280nm波長的光吸收即光密度的大小來測定一般蛋白質(zhì)的含量 。 ? 考馬斯亮藍(lán) G250是一種染料 ， 在游離狀態(tài)下呈紅色 ， 與蛋白質(zhì)結(jié)合則呈現(xiàn)藍(lán)色 。 在一定范圍內(nèi) ， 溶液在 595nm波長下的吸光度與蛋白質(zhì)含量成正比 ， 可用比色法測定 。 ? 本法試劑配制簡單 ， 操作簡便 ， 是一種常見的蛋白質(zhì)快速微量測定方法 。 （二）蛋白質(zhì)純度鑒定 常用電泳法 (IEE、 PAGE和 SDSPAGE)、 HPLC法 、免疫學(xué)方法等 . 此外 , N末端分析 也用于純度鑒定 各種層析單峰 ， 電泳單帶 ， 雙向電泳單點(diǎn) ， 末端氨基 酸測定一種 ， 溶解度曲線單轉(zhuǎn)折點(diǎn) 。
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