蛋白質(zhì)分離技術(shù)-層析-資料下載頁(yè)
2025-04-30 12:07本頁(yè)面
【正文】 ous) ，在擴(kuò)散孔的基礎(chǔ)上增加了對(duì)流孔，在流速較高的條件下獲較好的分辨率； ? 殼聚糖 具有良好的生物相容性和化學(xué)穩(wěn)定性，近年來(lái)在疏水層析中也得到了應(yīng)用。 層析介質(zhì)的再生、貯存 ： ? 再生：常規(guī)用 蒸餾水 清洗，如有疏水性很強(qiáng)的物質(zhì)如脂類、變性蛋白等牢固結(jié)合在介質(zhì)上，則需合適的清洗劑進(jìn)行清洗， NaOH溶液是其中常用的一種清洗劑，它在清洗層析柱的同時(shí)還能使微生物鈍化失活起到 消毒的效果 。此外， 促溶鹽類的水溶液 也是良好的清洗劑。 ? 貯存：一般懸浮在 20%的乙醇中，如在水溶液體系中保存，則需添加一定量的防腐劑，以防止微生物的生長(zhǎng)。 HIC介質(zhì)的疏水配基主要為 烷基和芳香基 ，其烷基通常在 C8以下，芳香基多為苯基。 四 配基的選擇 偶聯(lián)至基質(zhì)的常見(jiàn)配基類型 （ A）丁基，（ B）辛基，（ C）苯基，（ D）新戊基 對(duì)某些蛋白而言，上述有些配基與其結(jié)合力太強(qiáng)，洗脫有時(shí)需用有機(jī)溶劑，有變性風(fēng)險(xiǎn)；具 中等疏水的高分子配基 (如聚乙二醇和聚丙二醇等 )不僅可提供足夠的結(jié)合力，且避免了上述缺點(diǎn)。 常用商品化疏水層析介質(zhì) ⒈ Octyl Sepharose 4 Fast Flow 工作 pH范圍為 313,清洗 pH范圍為 214,工作的最大速度是 600cm/h,配基結(jié)合量為每 ml50μmol 正辛烷基 ，疏水性中等，適合各種蛋白的分離和純化。 ⒉ Butyl Sepharose 4 Fast Flow 工作 pH范圍為 313，清洗 pH范圍為 214，工作的最大速度是 600cm/h,配基結(jié)合量為每 ml 50μmol 正丁烷基， 疏水性最弱，適合含脂族配體的生物分子。 ⒊ Phenyl Sepharose 6 Fast Flow 疏水性強(qiáng)，載量高，適合含芳香族配體的生物分子的預(yù)處理 ，配基結(jié)合量為每 ml40μmol ， 苯基Phenyl，工作 pH范圍為 313，清洗 pH范圍為 214，工作的最大速度是 600cm/h 。 ⒋ Phenyl Sepharose CL4B 疏水性較 正辛烷基 弱， 適用于分離和純化對(duì)疏水性尚未了解的蛋白 ，配基結(jié)合量為每 ml40μmol 苯基Phenyl；工作 pH范圍為 313，清洗 pH范圍為 214，工作的 最大速度是 50cm/h 。 五 疏水層析的影響因素 鹽類和鹽組成 ? 流動(dòng)相中鹽的組成對(duì)蛋白質(zhì)在疏水層析介質(zhì)上的吸附能力具有最為重大的影響。 ? 選擇合適的鹽對(duì)保證蛋白質(zhì)的分離以及分離后蛋白質(zhì)的活性都很重要。 硫酸銨、醋酸銨、氯化鈉和磷酸鹽是疏水層析分離常用的幾種鹽。 ? 離子強(qiáng)度 離子強(qiáng)度的大小直接影響樣品組分在固定相的 保留值 。一般增加離子強(qiáng)度來(lái)增加組分的保留值，降低離子強(qiáng)度來(lái)提高組分的解析附能力。 HIC實(shí)驗(yàn)中，改變離子強(qiáng)度進(jìn)行洗脫的方式，一般宜采用梯度洗脫法，可提高分離的選擇性。 ? 溶液的酸堿度 溶液的 pH值主要考慮能維持生物大分子生物活性的 pH環(huán)境。一般情況，溶液的 pH接近蛋白質(zhì)的等電點(diǎn) ，其疏水性增加，有利于與固定相配基相互作用； 遠(yuǎn)離其等電點(diǎn) ，其疏水性減少，不利于與固定相配基結(jié)合，但有利于蛋白質(zhì)洗脫。因此通過(guò)改變?nèi)芤旱?pH也可以改變蛋白質(zhì)的疏水性。 ? 柱溫 一般柱溫升高，生物大分子的構(gòu)象會(huì)發(fā)生變化， 疏水作用增加 ，吸附能力增加，有利于提高層析柱的分離度，所以有時(shí)可以通過(guò)提高柱溫來(lái)增加疏水基團(tuán)與配基間的相互作用，分離性質(zhì)相近的化合物，如對(duì)分離一些小分子是非常有效的。但是對(duì)于具有生物活性的物質(zhì)或酶類，在高溫條件下易變性失活，因此不宜在高溫條件下進(jìn)行分離。一般都在常溫或低溫下操作。 六、疏水層析的 優(yōu)點(diǎn) 原則上可用于所有蛋白質(zhì)純化，處理量大，特別是從大體積樣品中提取低含量的目標(biāo)蛋白顯優(yōu)勢(shì) 對(duì) DNA及小牛血清 (其中的白蛋白、免疫球蛋白、氨基酸等成分 )去除率較高，尤其是對(duì)細(xì)胞DNA一步去除率可達(dá) 90％以上 一般放在純化工藝的最前面。 條件溫和，不易使蛋白變性。 可用于蛋白的濃縮。 在純化方案中，疏水作用層析可以用于樣品的捕獲、中度純化、精細(xì)純化。 各種層析的效果對(duì)比： ? IEC 離子交換層析 ? AC 親和層析 作業(yè)： 繪制某一蛋白的純化流程圖 要求： 注明每一步的純化條件和純化 方法。 必須包括粗分級(jí)分離和細(xì)分級(jí)分離（層析）兩個(gè)步驟。 A4紙雙面打印
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