【正文】 : 氣體常數(shù)； T：絕對溫度； ?：滲透壓； c: 溶質(r243。ngzh236。)的濃度。,本卷須知：盡量采用等電點或者接近等電點的緩沖溶液(huǎn chōnɡ r243。nɡ y232。)做為半透膜內外的溶劑，以防止PH值對滲透壓的影響。,滲透壓法測定蛋白質分子量的優(yōu)缺點： 優(yōu)點：裝置簡單，準確度相對高。 缺點：不能區(qū)別所測蛋白質溶液中的蛋白質樣品是否(sh236。 fǒu)均一。如果溶液含多種蛋白質成分，那么測出的是幾種蛋白質的平均分子量。,第九十一頁，共一百一十三頁。,〔三〕蛋白質的擴散(ku242。s224。n)和擴散(ku242。s224。n)系數(shù),擴散〔平移擴散〕：由于(y243。uy)濃度差引起的溶質分子的凈遷移。,擴散系數(shù)D：在數(shù)值上等于(děngy)當濃度梯度為一個單位時，在一秒鐘內通過1cm2面積所擴散的溶質量。,第九十二頁，共一百一十三頁。,〔四〕沉降分析法測定(c232。d236。ng)相對分子質量,需轉速(zhu224。n s249。)為60,000～80,000rpm的超速離心機,沉降：蛋白質分子在溶液中受到強大的離心力作用時，如果蛋白質的密度大于溶液的密度，蛋白質分子就會發(fā)生(fāshēng)沉降，沉降的速度與蛋白質的分子大小、形狀、密度以及溶液的性質有關。,第九十三頁，共一百一十三頁。,1. 沉降速度法測定相對分子(fēnzǐ)質量,沉降系數(shù)(s):單位(dānw232。i)離心場的沉降速度。,界面移動的速度即沉降速度，溶質的相對分子量越大，那么界面移動越快，假設溶液中有幾種溶質，那么離心之后就會出現(xiàn)幾個界面。界面移動的速度可以(kěyǐ)借助適當?shù)墓鈱W系統(tǒng)來觀察。,第九十四頁，共一百一十三頁。,如人血紅蛋白沉降系數(shù)s=4.46S，即4.4610－13秒。 為了比較起見，在不同溫度和溶劑中測得的沉降系數(shù)需要換算成標準(biāozhǔn)條件下的s值。沉降系數(shù)的標準(biāozhǔn)條件定為20?C,溶劑為水。校正后的沉降系數(shù)用s20，w表示。,大局部生物大分子的沉降系數(shù)介于11013到2001013秒的范圍。因此：把1013秒作為一個單位，稱為斯維得貝格單位或稱沉降系數(shù)單位，用S(大寫(d224。xiě))來表示。 即：1S＝1013秒,第九十五頁，共一百一十三頁。,蛋白質分子量與沉降系數(shù)的關系(guān x236。),第九十六頁，共一百一十三頁。,2. 沉降(ch233。nji224。ng)平衡法測定相對分子質量,利用較低轉速〔8000~20000 r/min〕進行(j236。nx237。ng)。由于分子顆粒沉降造成濃度梯度，因而產生了擴散作用。,第九十七頁，共一百一十三頁。,第九十八頁，共一百一十三頁。,利用凝膠過濾可以把蛋白質混合物按分子(fēnzǐ)的大小別離開來,〔五〕凝膠過濾法測定(c232。d236。ng)相對分子質量,洗脫過程,第九十九頁，共一百一十三頁。,如果某種蛋白質與一理想的非水化球體(qitǐ)具有相同的過柱速度即相同的洗脫體積〔elution volume〕,那么認為這種蛋白質具有與此球體相同的半徑,稱蛋白質分子的斯托克半徑。 因此,標準蛋白質(Mr和斯托克半徑)和待測蛋白質必須具有相同的分子形狀(接近球體),否那么不能得到比較準確的Mr。,注意：分子形狀為線形的或與凝膠能發(fā)生吸附作用(zu242。y242。ng)的蛋白質,那么不能用此方法測定Mr。,第一百頁，共一百一十三頁。,Gel filtration column,第一百零一頁，共一百一十三頁。,第一百零二頁，共一百一十三頁。,第一百零三頁，共一百一十三頁。,1966年Andrews提出(t237。 chū)了一個經驗公式,①方法簡便，儀器簡單。 ②不純樣品(y224。ngpǐn)亦可，只要找出活性峰位置〔Ve〕即可。,第一百零四頁，共一百一十三頁。,(六) SDS －PAGE法測定相對(xiāngdu236。)分子質量,SDS處理蛋白質之后，所有的SDS蛋白質復合物都帶有了大量的負電荷，而且分子都呈現(xiàn)(ch233。ngxi224。n)統(tǒng)一的長橢圓形。,第一百零五頁，共一百一十三頁。,在聚丙烯酰胺凝膠中由于引入凝膠分子篩效應(xi224。oy236。ng),電泳遷移率與蛋白質分子量的對數(shù)有以下關系：,第一百零六頁，共一百一十三頁。,第一百零七頁，共一百一十三頁。,第四節(jié) 蛋白質含量(h225。nli224。ng)的測定與純度鑒定,第一百零八頁，共一百一十三頁。,一、 蛋白質含量(h225。nli224。ng)測定,凱氏定氮法：是經典的標準方法,但現(xiàn)在在生物學上已不多用。 雙縮脲法：純化步驟(b249。zh242。u)檢測。 Folin酚試劑法(Lowry法) ：蛋白質標準測定方法。 紫外吸收法：雖然精確度不高,但操作簡便。 Bradford法(考馬斯亮藍結合法)：靈敏度高,能檢測μg級的蛋白。,第一百零九頁，共一百一十三頁。,二、 蛋白質純度(chnd249。)鑒定,1.電泳分析法：純的蛋白質電泳只呈現(xiàn)(ch233。ngxi224。n)單一區(qū)帶。,2.沉降分析法：純的蛋白質在離心場中以單一(dānyī)的沉降速度移動。,3.HPLC鑒定：純的多肽、蛋白質呈現(xiàn)出單一的對稱峰。,4.溶解度分析：純的蛋白質制品，溶解度曲線呈現(xiàn)一個折點。,5.N末端分析：N末端殘基只可能有一種氨基酸。,第一百一十頁，共一百一十三頁。,蛋白質等電點 等離子點 鹽析 鹽溶 蛋白質的變性 復性 茚三酮反響 雙縮脲反響 層析 離子交換層析 凝膠過濾層析 親和層析 透析 電泳 SDSPAGE 等電聚焦(j249。jiāo) 雙向電泳 滲透現(xiàn)象 擴散 擴散系數(shù) 蛋白質的沉降 沉降系數(shù) 蛋白質的斯托克半徑,名詞解釋,第一百一十一頁，共一百一十三頁。,知識點,蛋白質的膠體性質 蛋白質的沉淀方法 蛋白質變性后的主要特征(t232。zhēng) 蛋白質別離純化的一般步驟 蛋白質別離純化的標準和主要方法 蛋白質分子量測定的主要方法 蛋白質含量測定與純度測定的主要方法,第一百一十二頁，共一百一十三頁。,內容(n232。ir243。ng)總結,蛋白質的理化性質及別離純化。當?shù)鞍踪|處于等電點時,加熱凝固最完全和最迅速。(2) 細胞破碎：選擇適當?shù)姆椒?將組織和細胞破碎。b.如果所要純化蛋白質與細胞膜或膜質細胞器結合,那么用超聲波或去污劑使膜結構解聚，然后用適當介質提取。依次洗脫收集后，通過(tōnggu242。)紫外吸收法測定吸收峰。粉末電泳：支持介質是淀粉、纖維素粉或硅膠粉。經常只需一步處理即可將某種所需蛋白質從復雜混合物中別離出來，純度相當高。蛋白質分子量測定的主要方法,第一百一十三頁，共一百一十三頁。,