【正文】 233。ng)的方法把任何一種蛋白質(zhì)從復雜的混合蛋白質(zhì)中純化出來。 但對任何一種蛋白質(zhì)都可能選擇一套適當?shù)膭e離純化程序以獲得高純度的制品。,第二十頁，共一百一十三頁。,一、蛋白質(zhì)別離純化的一般(yībān)步驟,第二十一頁，共一百一十三頁。,一、蛋白質(zhì)別離純化(chn hu224。)的一般步驟,(1) 去除雜質(zhì)： a.動物材料：先剔除結締組織和脂肪組織。 b.種子材料：先去殼去種皮以免受單寧等物質(zhì)污染。 c.油料(y243。u li224。o)種子：先用低沸點的有機溶劑如乙醚等脫脂。,1.蛋白質(zhì)樣品(y224。ngpǐn)的前處理,(2) 細胞破碎：選擇適當?shù)姆椒?將組織和細胞破碎。 a.動物材料：電動搗碎機、勻漿機或用超聲波處理。 b.植物材料：與石英砂或玻璃粉研磨、用纖維素酶處理。 c.細菌：與砂研磨,高壓擠出或溶菌酶處理等。,第二十二頁，共一百一十三頁。,(1) 去除雜質(zhì)。 (2) 細胞破碎。 (3) 溶 提：選擇適當?shù)木彌_液把所要的蛋白質(zhì)提取(t237。qǔ)出來。,a.如果所要的蛋白質(zhì)主要集中在某一細胞組分, 可利用差速離心別離。 b.如果所要純化蛋白質(zhì)與細胞膜或膜質(zhì)細胞器結合,那么用超聲波或去污劑使膜結構解聚，然后用適當介質(zhì)(ji232。zh236。)提取。,1.蛋白質(zhì)樣品(y224。ngpǐn)的前處理,第二十三頁，共一百一十三頁。,2.蛋白質(zhì)粗提液的粗分級別離,第二十四頁，共一百一十三頁。,3.濃縮(n243。nɡ suō)蛋白質(zhì)的細分級別離,主要方法： 凝膠過濾、離子交換層析(c233。nɡ xī)、吸附層析(c233。nɡ xī)、親和層析(c233。nɡ xī)等。,輔助(fǔzh249。)方法： 電泳法〔包括區(qū)帶電泳,等電聚焦等〕,第二十五頁，共一百一十三頁。,4. 蛋白質(zhì)的結晶(ji233。jīng),結晶是蛋白質(zhì)別離純化的最后步驟。盡管結晶并不能保證蛋白質(zhì)一定是均一的,但只有某種蛋白質(zhì)在溶液中數(shù)量上占優(yōu)勢時才能(c225。in233。ng)形成結晶。重結晶又可除去少量夾雜的蛋白質(zhì)。,蛋白質(zhì)的結晶不僅是純度的一個標志,也是斷定制品處于天然狀態(tài)的有力指標。 只有獲得蛋白質(zhì)晶體(jīngtǐ)才能對它進行X射線結構分析。,第二十六頁，共一百一十三頁。,一、蛋白質(zhì)別離(fēnl237。)純化的一般步驟,第二十七頁，共一百一十三頁。,二、蛋白質(zhì)的別離(fēnl237。)純化方法,主要是根據(jù)(gēnj249。)蛋白質(zhì)在溶液中的性質(zhì)不同對蛋白質(zhì)進行別離。,第二十八頁，共一百一十三頁。,〔一〕根據(jù)蛋白質(zhì)分子大小不同的純化(chn hu224。)方法,主要(zhǔy224。o)方法： 1：透析〔dialysis〕和超過濾〔ultrafiltration〕 2：密度梯度〔區(qū)帶〕離心 3：凝膠過濾法,第二十九頁，共一百一十三頁。,1：透析和超過濾〔利用蛋白質(zhì)分子(fēnzǐ)不能通過半透膜的性質(zhì)〕,第三十頁，共一百一十三頁。,將濃縮液裝在一個用半透膜的透析袋內(nèi)，兩端都密封好，然后將透析袋懸浮在一個裝有緩沖液的容器內(nèi)進行透析。 由于透析袋內(nèi)溶液濃度高而袋外濃度低，因此，透析袋內(nèi)外將進行物質(zhì)交換(jiāohu224。n)，袋內(nèi)溶質(zhì)向袋外滲透，趨向濃度平衡。,透析流程(lich233。ng),透析裝置(zhuāngzh236。),第三十一頁，共一百一十三頁。,蛋白質(zhì)等大分子不能透過半透膜，仍然留在袋內(nèi)。 但蛋白質(zhì)周圍的小分子可以與緩沖液進行交換。 通過(tōnggu242。)屢次更換透析液，就可除去小分子。,透析流程(lich233。ng),第三十二頁，共一百一十三頁。,超過濾裝置(zhuāngzh236。),使用壓力或者(hu242。zhě)離心力使蛋白質(zhì)溶液透過有一定截留分子量的超濾膜〔半透膜〕，到達濃縮蛋白質(zhì)溶液的目的。,第三十三頁，共一百一十三頁。,2：密度梯度〔區(qū)帶〕離心(l237。xīn),蛋白質(zhì)顆粒的沉降不僅(b249。jǐn)決定于它的大小,而且也取決于它的密度。,如果蛋白質(zhì)顆粒在具有密度梯度的介質(zhì)〔常用蔗糖梯度〕中離心時,質(zhì)量和密度(m236。d249。)大的顆粒比質(zhì)量和密度(m236。d249。)小的顆粒沉降得快,并且每種蛋白質(zhì)顆粒沉降到與自身密度(m236。d249。)相等的介質(zhì)密度(m236。d249。)梯度時,即停止不前,最后各種蛋白質(zhì)在離心管中被別離成各自獨立的區(qū)帶(zone)。,第三十四頁，共一百一十三頁。,?裝好具備密度梯度的介質(zhì)溶液,密度梯度〔區(qū)帶〕離心(l237。xīn)流程圖,?離心(l237。xīn),?參加(jiār249。)：混和蛋白質(zhì)樣品,,離心裝置,第三十五頁，共一百一十三頁。,3：凝膠過濾法,凝膠過濾是按照蛋白質(zhì)分子大小(d224。xiǎo)進行別離的技術，又稱凝膠層析、分子篩層析或排阻層析。 凝膠過濾法是根據(jù)分子大小別離蛋白質(zhì)混合物最有效的方法之一。,第三十六頁，共一百一十三頁。,〔1〕凝膠過濾(gu242。lǜ)的介質(zhì),凝膠過濾所用(suǒ y242。nɡ)的介質(zhì)是裝在凝膠柱里的凝膠珠〔或稱凝膠顆粒、凝膠球〕。 其內(nèi)部是多孔的網(wǎng)狀結構，單個凝膠珠本身象個“篩子〞。不同類型凝膠的篩孔的大小不同 。,凝膠柱,第三十七頁，共一百一十三頁。,Sephadex 交聯(lián)葡聚糖 Biogel P 聚丙烯酰胺凝膠 Sepharose或Biogel A 瓊脂糖凝膠,〔２〕凝膠介質(zhì)顆粒(kēl236。)的選擇,凝膠的交聯(lián)度或孔度〔網(wǎng)孔大小〕決定了凝膠的分級別離范圍，即能被該凝膠別離開來的蛋白質(zhì)混合物的相對分子質(zhì)量范圍進行凝膠過濾。 凝膠過濾所用的凝膠孔徑(kǒngj236。ng)大小的選擇主要取決于要純化的蛋白質(zhì)分子量。,第三十八頁，共一百一十三頁。,〔３〕凝膠過濾(gu242。lǜ)的原理：,當含有大小不同的蛋白質(zhì)樣品加到凝膠柱上時，比凝膠珠平均孔徑小的蛋白質(zhì)就可以穿入珠子的內(nèi)部。 這樣在洗脫時，小分子不但其運動(y249。nd242。ng)路程長，而且受到來自凝膠珠內(nèi)部的阻力也很大，所以越小的蛋白質(zhì)，把它們從柱子上洗脫下來所花費的時間越長。,凝膠中只有很少的孔徑可接受大的蛋白。因此，大的蛋白質(zhì)直接通過凝膠珠之間的縫隙首先被洗脫(xǐ tuō)下來。,第三十九頁，共一百一十三頁。,凝膠過濾(gu242。lǜ)別離蛋白質(zhì)的流程,第四十頁，共一百一十三頁。,這樣(zh232。y224。ng)大小不同的蛋白質(zhì)就被別離開來了。,依次(yīc236。)洗脫收集后，通過紫外吸收法測定吸收峰。,第四十一頁，共一百一十三頁。,〔一〕根據(jù)蛋白質(zhì)分子(fēnzǐ)大小不同的純化方法,主要(zhǔy224。o)方法： 1：透析〔dialysis〕和超過濾〔ultrafil