蛋白質(zhì)的分離純化剖析-資料下載頁
2025-10-26 05:30本頁面
【正文】 型。改型就是用適當(dāng)?shù)碾x子平衡，使交換劑帶上希望的離子。陽離子和陰離子交換劑最后分別為Na和Cl型是最穩(wěn)定形式。,洗脫速度：太快或太慢都會(huì)降低(ji224。ngdī)柱的分辨率。 分級物收集量：關(guān)系到能否充分代表層析柱的分辨率。一般總洗脫體積在500—2000ml時(shí)，每管收集5—10ml,〔五〕離子交換(l237。 zǐ jiāo hu224。n)劑的處理和再生,離子交換劑價(jià)格較貴，用后再經(jīng)過再生處理，可反復(fù)屢次使用。處理時(shí)防止用強(qiáng)酸或強(qiáng)堿長時(shí)間浸泡，以防載體的糖鏈結(jié)構(gòu)遭水解破壞。,第四十頁，共六十一頁。,各類離子交換(l237。 zǐ jiāo hu224。n)劑的再生條件,第四十一頁，共六十一頁。,血清蛋白常用離子交換層析別離。IgG可用QAE—Sephadex A—50或DEAE—Sephadex A—50別離?，F(xiàn)在臨床上有重要(zh242。ngy224。o)用途的許多血清蛋白，如白蛋白，factor IX復(fù)合物和專一性免疫球蛋白已用離子交換層析大規(guī)模生產(chǎn)。,〔六〕離子交換(l237。 zǐ jiāo hu224。n)層系的應(yīng)用實(shí)例,第四十二頁，共六十一頁。,凝膠層析又稱凝膠滲透層析、排阻層析，分子篩層析等。它主要用于別離分子大小不同的生物大分子及測定其分子量。凝膠層析設(shè)備(sh232。b232。i)簡單，操作簡便，每次層析后無需再生處理，因此，在生化研究中應(yīng)用及其廣泛。,三、凝膠過濾(gu242。lǜ)層析,第四十三頁，共六十一頁。,凝膠層析載體是多孔凝膠。當(dāng)溶質(zhì)通過層析柱時(shí)，溶質(zhì)分子不僅是向下運(yùn)動(dòng)，而且還在做無定向擴(kuò)散運(yùn)動(dòng)。分子直徑比凝膠孔徑大的分子，不能進(jìn)入凝膠顆粒的微孔里，只能經(jīng)過凝膠顆粒之間的孔隙。這樣的分子是隨溶劑一起移動(dòng)的，因而最先流出柱外；而分子直徑比凝膠孔徑小的分子，那么能夠自由進(jìn)入凝膠顆粒的微孔之中，即進(jìn)入凝膠相內(nèi)。小分子向下移動(dòng)的速度必然(b236。r225。n)要落后于大分子。凝膠顆粒是固定相，洗脫液是流動(dòng)相。,(一) 根本原理,第四十四頁，共六十一頁。,溶質(zhì)分子在柱上移動(dòng)的速度〔即被凝膠顆粒阻滯的程度〕決定于該分子在兩相間的分配常數(shù) Kd。Kd由下式計(jì)算： Kd=(VeVo)/Vp 式中Ve為某種物質(zhì)從柱內(nèi)完全洗脫出來(chū l225。i)時(shí)洗脫液的體積；Vo為膠粒之間空隙的總?cè)莘e，也稱外水體積；Vp為膠粒內(nèi)部孔隙的總?cè)莘e，稱內(nèi)水體積。假設(shè)分子大，完全不能進(jìn)入膠粒微孔，那么最先流出柱，此時(shí)Kd=0；假設(shè)分子小，能完全進(jìn)入膠粒微孔，那么最 后流出柱，此時(shí)Kd=1對中等大小的分子，只能局部進(jìn)入膠粒微孔，所以Kd值在0—1之間。不同溶質(zhì)是按Kd由小到大的順序流出柱。,第四十五頁，共六十一頁。,凝膠過濾法的分辨率是凝膠層析中的另一個(gè)重要的特征性常數(shù)。從數(shù)學(xué)概念(g224。ini224。n)上考慮，別離分辨率可以表示為：,VV2是兩種物質(zhì)的洗脫體積，可以從加樣品開始到洗脫峰的最高點(diǎn)為止的洗脫體積計(jì)算。 WW2分別為兩個(gè)物質(zhì)的洗脫峰的寬度，可以由通過峰邊拐點(diǎn)的兩條切線與基線(jīxi224。n)交點(diǎn)間的距離來計(jì)算。兩個(gè)物質(zhì)要完全別離，ρ必須大于或等于1。影響分辨率的因素很多，如凝膠粒度、上樣量、流速、溫度、凝膠類型及層析柱的形狀等。,ρ=,2〔V2V1),W1+W2,第四十六頁，共六十一頁。,第四十七頁，共六十一頁。,第四十八頁，共六十一頁。,第四十九頁，共六十一頁。,第五十頁，共六十一頁。,第五十一頁，共六十一頁。,第五十二頁，共六十一頁。,第五十三頁，共六十一頁。,第五十四頁，共六十一頁。,第五十五頁，共六十一頁。,第五十六頁，共六十一頁。,第五十七頁，共六十一頁。,第五十八頁，共六十一頁。,第五十九頁，共六十一頁。,第六十頁，共六十一頁。,內(nèi)容(n232。ir243。ng)總結(jié),第一節(jié) 引言。活性：要求大分子保持天然構(gòu)象(ɡ242。u xi224。nɡ)狀態(tài)，有高度的生物活性。③別離純化：包括粗分級別離和細(xì)分級別離。其中前兩個(gè)階段為別離純化的前處理。一般動(dòng)物組織和細(xì)胞可用電動(dòng)搗碎機(jī)或勻漿器破碎或用超聲波處理破碎。常用的電泳方法有聚丙烯酰胺凝膠電泳、等電聚焦電泳。特征：有一個(gè)固定相和一個(gè)流動(dòng)相。二乙基氨基乙基。柱床體積：至少要比結(jié)合所有樣品所需要的要大2—5倍。W1+W2,第六十一頁，共六十一
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