蛋白質(zhì)免疫印跡技術(shù)-資料下載頁
2025-04-30 12:07本頁面
【正文】 解 配置（加少量 NaOH促溶） （周四下午） 。 動物的常規(guī)免疫 苦味酸（以 75%乙醇配置）標記小鼠 標記部位 組號 頭 1 左前肢 2 左后肢 3 背 4 右前肢 5 右后肢 6 左耳朵 7 右耳朵 8 ? 初級免疫 ：小鼠背部多點皮下注射， 鼠 （ 1）抗原與佐劑的混合：取 完全佐劑 混合，震蕩混勻，制成 油包水 的形態(tài) （ 2）用酒精棉球消毒待注射部位 （ 3）皮下多點注射，每點注射量應(yīng)小于 初級免疫后仔細觀察小鼠對外源抗原的反應(yīng)，兩周后進行加強免疫 ? 加強免疫：初級免疫后兩周進行。 ? 取 混合震蕩混勻，制成油包水的形態(tài)。 ? 加強免疫 ：小鼠背部多點皮下注射， （ 1）用酒精棉球消毒待注射部位 （ 2）皮下多點注射，每點注射量應(yīng)小于 。 ? 第二次加強免疫 ：加強免疫一周后進行。操作相同。 ? 第二次加強免疫后一周，即可采血，收集抗血清。 ? 小鼠取血。收集的血液置于室溫下 1h左右，凝固后，置 4℃下，析出血清，離心， 3000rpm,10min。吸出血清，分裝（ ～ ），貯于 20℃ 以下冰箱保存。 Western Blot一般流程 ? 蛋白樣品的制備 ? SDS－ PAGE ?轉(zhuǎn)膜 ?封閉 ?一抗雜交 ?二抗雜交 ?底物顯色 轉(zhuǎn)移電泳設(shè)備 ? Western－ blotting 檢測抗血清 轉(zhuǎn)膜 半干法 將凝膠和固相基質(zhì)象三明治一樣加在用緩沖液濕 潤濾紙之間，電轉(zhuǎn) 10－ 30min。 濕法 將凝膠和固相基質(zhì)夾在濾紙中間，浸泡在轉(zhuǎn)移裝 置的緩沖液中，電轉(zhuǎn) 45min或過夜。 封閉 ? 脫脂奶粉（ 5％） ? BSA ? Western Blot 膜封閉液（生物試劑公司提供） 一抗、二抗孵育 ? 把硝酸纖維素濾膜放在密閉塑料袋或者培養(yǎng)皿中，根據(jù)濾膜面積以 。 37℃ 一小時， 4 ℃ 過夜。 ? 倒掉一抗溶液，用 PBS漂洗液濾膜 3次，每次 10min。 ? 加入用封閉液配制的二抗，搖床上緩慢搖動， 37℃ 一小時，4 ℃ 過夜。 ? 倒掉一抗溶液，用 PBS漂洗液濾膜 3次，每次 10min。 二抗與底物反應(yīng)顯色 ?辣根過氧化物酶法 （ HRP） ?堿性磷酸酶法（ AP） ?化學發(fā)光顯色法 ? 辣根過氧化物酶 EC 。一種糖蛋白，由于在辣根中該酶的含量很高，故名。 ? 它以鐵卟啉為輔基，在過氧化氫存在時能催化苯酚、苯胺及其取代物聚合。 ? HRP常用的生色底物有： ? DAB— 二氨基聯(lián)苯胺 ? TMB— 四甲基聯(lián)苯胺 ? OPD— 鄰苯二胺 ? 一般免疫印跡中，顯色反應(yīng)采用生成不溶性產(chǎn)物的底物 DAB。 五、實驗結(jié)果與分析 酶標法顯色 化學發(fā)光法顯色 六、思考題 1. 影響制備特異性強、效價高的抗血清的因素有哪些？ 2. 如何保存抗血清？ 3. 如何檢測抗血清？原理是什么？
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