【正文】 樣可使其迅速吸收反應(yīng)溶液中的液體，以增加HRP—CHO和IgG的反應(yīng)濃度，而小分子交聯(lián)劑(NaIO4)則可被分子篩G—25吸進(jìn)微孔中，以借此控制并降低反應(yīng)系統(tǒng)中NaIO4的相對(duì)濃度。此舉有助于加速HRP—Ab結(jié)合物的形成； ⑤在標(biāo)記時(shí)，所采用的HRP／IgG摩爾比應(yīng)略高于1的比例，以保證HRP與IgG充分相互結(jié)合； ④對(duì)Schiff氏堿的穩(wěn)定化作用，是采取類似于還原性甲基化反應(yīng)的方法進(jìn)行的，因?yàn)榕饸浠c在水溶液中幾乎立即水解，所以要重復(fù)加入一次，同時(shí)孵溫時(shí)間也縮短許多。 ⑥在使用ConA—Sepharose親和層析對(duì)結(jié)合物進(jìn)行純化時(shí)，只有在HRP的糖基部分沒有被NaIO4過分氧化，即高碘酸鈉的濃度低于15mmol時(shí)，才能進(jìn)行有效的純化。 [附]Tussen—Kurstak 改良法簡(jiǎn)要步驟(時(shí)間：1天)[23] (1)活化 辣根過氧化物酶(HRP)的活化 ①在青霉素瓶中用新鮮配制的0．5ml~0．1mol／L碳酸氫鈉溶液溶解5mg純化的HRP(用雙蒸水配制)； [配制]0．1mol／L NaHCO3：16．8mg NaHCO3溶于2m1雙蒸水中； (注意：此時(shí)溶液顏色呈棕色) ②在上述酶液中逐滴加入新鮮配制的0．5ml 8~16mmol／L NaIO4(根據(jù)HRP使用量確定)，加塞，避光，室溫(20℃)條件下慢速電磁攪拌反應(yīng)2小時(shí)； [配制]20mmol／L NaIO4：21．4mg NaIO4溶于5ml雙蒸水中； (注意：在滴加NaIO4的過程中，反應(yīng)液的顏色應(yīng)由棕色逐漸變?yōu)榘稻G色，如無變化，可加少許固體NaIO4) (2)標(biāo)記 活化HRP—CHO與IgG交聯(lián) ①用0．1mol／LNaHCO3： (1~2ml)溶解15mg純化的IgG； ②將HRP—CHO與IgG溶液混合，攪拌，把干燥的5ephadex G—25加入其中(G—25加入量相當(dāng)于HRP和IgG總量的l／6)室溫?cái)嚢璺磻?yīng)2~3小時(shí)， (3)穩(wěn)定化 ①?gòu)纳鲜鼋宦?lián)反應(yīng)液中離心分離出Sephadex G—25； ②加入1／20體積的新鮮配制的5mg／ml NaBH4(在0．1mmol／L NaOH中)，30分鐘后再加入3／20體積的另外新配制的NaBH4溶液，放置一小時(shí)，使Schiff氏堿還原成穩(wěn)定的酶標(biāo)抗體結(jié)合物； (4)純化用等體積的飽和硫酸銨溶液將結(jié)合物和游離的IgG沉淀，收集沉淀物，用PBS溶解并充分透析。 ②準(zhǔn)備一支小的ConA—Sepharose柱，加入上述溶液，用PBS洗脫游離的IgG，吸附的結(jié)合物則用含有0．Olmol／L甲基—a—D—甘露(糖)吡喃糖普的PBS洗脫； (說明：如果HRP和IgG的純度較高，上述純化過程可以省略)； ③在加入等體積的甘油后，將結(jié)合物置于一20℃保存。 2．異型雙功能交聯(lián)劑SPDP制備酶標(biāo)抗體結(jié)合物[17，18] 酶標(biāo)抗體結(jié)合物的制備，常使用同型雙功能交聯(lián)劑，如戊二醛、碳二亞胺等。使用這類交聯(lián)劑的缺點(diǎn)是在生成結(jié)合物的同時(shí)，還不可避免產(chǎn)生酶—酶和抗體—抗體的自身聚合物，致使結(jié)合物產(chǎn)量低，活性也不高。高碘酸鈉法制備的結(jié)合物活性雖較高，但也有一定的自身聚合；同時(shí)由于Sehiff氏堿的形成，結(jié)合物不穩(wěn)定，必需用硼氫化鈉還原，繼而又會(huì)造成抗體和酶活性的明顯丟失，且此法又僅限于HRP。Carlsson等[17]應(yīng)用異型雙功能交聯(lián)劑N—琥珀酰亞胺基3—(2—吡啶基二硫）丙酸酯（NSucCinimidyl3(2—pyridyldithie)propionate，SPDP)制備蛋白—蛋白結(jié)合物，Nilsson等[24]應(yīng)用SPDP制備HRP—IgG結(jié)合物，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所王世中等[18]SPDP／HRP、SPDP／IgG、HRP／IgG的不同使用比例對(duì)交聯(lián)標(biāo)記產(chǎn)物活性的影響進(jìn)行了研究，以期獲得活性較高的酶標(biāo)抗體結(jié)合物，同時(shí)還研究了從結(jié)合物中除去游離HRP和游離IgG的方法。 SPDP法制備HRP—IgG結(jié)合物簡(jiǎn)要步驟： 1)用SPDP處理HRP。5mg HRP， ／L PBS(pH7．5)中，迅速滴入一定量(表2—6)SPDP液(溶于無水乙醇)，在23~25。C反應(yīng)30分鐘，同時(shí)輕輕攪拌。反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液通過Sephadex G—25往以除去多余的SPDP及副產(chǎn)物，平衡及洗脫液均為0．1mol／L醋酸緩沖液；pH4．5(含0．1mo1／L NaCl)。收集酶蛋白部分(簡(jiǎn)稱HRP—PDP)，必要時(shí)進(jìn)行濃縮。 2)用SPDP處理IgG：基本上與HRP的處理步驟相同，僅在用G—25分離時(shí)，平衡及洗脫緩沖液是o．1m01／L PBS pH7．5，收集IgG部分(簡(jiǎn)稱IgG—PDP)，必要時(shí)進(jìn)行濃縮。 3)HRP—PDP的還原：取上述HRP—PDP溶液，加入固體DTT(二硫蘇糖醇)，使其終濃度達(dá)到25mmo1／L，在23~25℃反應(yīng)約25分鐘，不時(shí)攪拌。反應(yīng)結(jié)束后，過Sephadex G—25柱。平衡及洗脫緩沖液為0．1mol／L PBS pH7．5，收集酶蛋白部分(簡(jiǎn)稱HRP—SH)，必要時(shí)進(jìn)行濃縮。置20小時(shí)，不時(shí)取出輕搖，再放回4（℃）冰箱中；反應(yīng)結(jié)束后，將溶液濃縮至0．5ml。其中產(chǎn)物主要是HRP—IgG結(jié)合物。 5)HRP—IgG中游離HRP的除去：用Sephacryl S—200，層析柱為671．3cm，床體積為88ml，／L PBS pH7．5，收集第一峰，測(cè)定各管A280nm和Ad403nm，第二峰主要是游離的HRP，呈淺棕色。 6)HRP—IgG中游離IgG的去除：在HRP—IgG結(jié)合物中可能含有少量游離IgG，需用ConA—Affi—Gel柱除去。 7)在上述標(biāo)記過程中，凡涉及G—25層析步驟時(shí)，均可以透析法代替之。(五)酶與半抗原的交聯(lián)由于酶標(biāo)半抗原與人工抗原都是由蛋白質(zhì)(酶蛋白或載體蛋白)與小分子化合物(藥物，毒物，激素等)組成的結(jié)合物(表2—7)。因此，兩者的交聯(lián)制備方法從化學(xué)角度來看，是完全相同或基本類似的。所以，用作免疫原的人工抗原(即半抗原與載體蛋白結(jié)合物)的制備方法，大體上都可用作酶免疫分析試劑的酶標(biāo)半抗原結(jié)合物的制備。但是，兩者亦有差異。 酶標(biāo)半抗原是作為酶免疫分析(ELISA或EMIT)的檢測(cè)試劑(稱檢測(cè)抗原)，因此，要求此結(jié)合物既有酶的活性，又具有抗原活性；而人工抗原則是作為免疫原的，其中的半抗原只有與載體蛋白結(jié)合后才具有免疫原性，在這里，載體蛋白僅僅作為載體，以在被免疫的動(dòng)物體內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生抗體。所以，在進(jìn)行化學(xué)交聯(lián)時(shí)，對(duì)兩種交聯(lián)產(chǎn)物(結(jié)合物中蛋白活性的要求差異很大，對(duì)于酶蛋白應(yīng)盡量保持其活性，對(duì)于載體蛋白則無嚴(yán)格要求，一般地說，只要不變性即可。 人工抗原的合成是化學(xué)免疫的重要問題，化學(xué)免疫研究的對(duì)象，除上面提及的藥物、毒物、激素外，還有多糖類、神經(jīng)遞質(zhì)、肽類、核酸及生物體內(nèi)其它小分子活性物質(zhì)，總起來說，它們大多都是無免疫原性的半抗原，在對(duì)其進(jìn)行免疫學(xué)及其它相關(guān)研究時(shí)，一方面要通過化學(xué)合成的手段，即蛋白質(zhì)連接技術(shù)，經(jīng)與載體蛋白交聯(lián)合成制備人工抗原，繼而用其免疫動(dòng)物制備相應(yīng)的抗體或單克隆抗體，作為研究用的探針；另一方面還必須將此探針用各種標(biāo)記物進(jìn)行標(biāo)記，如本文論及的酶標(biāo)記，以便用作研究工具；在分子生物學(xué)研究中，包括核酸或基因探針的研究及應(yīng)用，多種類型探針的標(biāo)記也都將涉及蛋白質(zhì)連接技術(shù)。 半抗原分子量一般較小，其結(jié)構(gòu)及化學(xué)功能團(tuán)的性質(zhì)多種多樣，數(shù)量各不相同，在與酶蛋白或載體蛋白進(jìn)行交聯(lián)時(shí)，必須考慮交聯(lián)雙方的性質(zhì)、交聯(lián)劑、交聯(lián)方法和載體. 2．混合酸酐法制備G6PDH(葡糖6磷酸脫氫酶)標(biāo)記利多卡因(Lidocaine, Li)結(jié)合物[29] (1)Li—混合酸酐的制備 首先將Li經(jīng)化學(xué)修飾(琥珀酸酐法，略)，在其分子中引入羥基(COOH)，制成LiCOOH(Li琥珀酸半酯)；然后，將此LiCOOHl0mg ()溶于375ul的DMF中，用電磁攪拌混溶。在10℃條件下，邊攪動(dòng)邊滴入21ul的三乙胺，再緩慢滴入 14ul的卡必醇氯甲酸酯，于10℃繼續(xù)攪拌反應(yīng)1．5小時(shí)，此全部過程應(yīng)保持無水，即獲得Li混合酸酐(LiMA)。 (2)酶底物溶液的制備 在冰浴中，將G6FDH(L．m) l mg用50mmol／，同時(shí)加入G6PNa(葡糖6磷酸鈉鹽)10mg及NADH 3mg(底物輔酶系統(tǒng)，用于保護(hù)酶活性)，使其溶解，隨后緩慢加入300ul卡必醇，用2mol／L 。 (3)G6PDHLi的交聯(lián) 將酶底物溶液置于冰浴中，在攪拌條件下，每隔10~15分鐘向此酶液中緩慢加入一定量(25ul，50ul，100ul……)的LiMA溶液，反應(yīng)10~15分鐘后，而抗體對(duì)酶活性的抑制率又最高 時(shí)，此標(biāo)記過程即完成(表2—8) 表2—8 G6PDH—Lidocaine交聯(lián)反應(yīng)中酶活性變化及抗體抑制率 (EDC)制備人工抗原最近幾年，在對(duì)無免疫原性小分子物質(zhì)的化學(xué)免疫研究中，采用碳化二亞胺作為交聯(lián)劑制備合成人工抗原的工作愈來愈多，因?yàn)橛眠@種試劑進(jìn)行交聯(lián)最為方便，除交聯(lián)的一方作為載體的蛋白質(zhì)，具有多個(gè)氨基或羧基外，不少小分子化合物也具有此反應(yīng)基團(tuán)，或通過化學(xué)修飾引入羧基。因此，EDC交聯(lián)法已被廣泛應(yīng)用，并為大家所熟悉。然而，在實(shí)踐過程中，也遇到不少問題，給相關(guān)研究帶來不少困難，以下就有關(guān)問題略加討論。使用EDC試劑進(jìn)行化學(xué)交聯(lián)雖然非常方便，但它除具有同型雙功能交聯(lián)劑的缺點(diǎn)外，在合成人工抗原時(shí)，還會(huì)出現(xiàn)異常情況。 如前所述，EDC是一類非?；顫姷幕瘜W(xué)交聯(lián)劑，據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，它可以交聯(lián)含有多種類 型化學(xué)功能基團(tuán)的化合物，包括羧酸、胺、磷酸、醇類、含巰基化合物等。交聯(lián)過程至少可分為兩步：如圖2—l中的反應(yīng)①和反應(yīng)②，假定含氨基的半抗原與載體蛋白的交聯(lián)是通過酰胺鍵連接，如反應(yīng)②；然而，EDC也可以通過分子重排與蛋白的羧基結(jié)合，成一種穩(wěn)定的N—取代脲，這一反應(yīng)過程如圖2—l中的反應(yīng)①和③，在此反應(yīng)中，載體蛋白如是白蛋白，取代脲就結(jié)合到該蛋白的羧基上。 圖2—1 碳二亞胺法制備人工抗原交聯(lián)反應(yīng)的可能機(jī)制有人認(rèn)為，在用EDC合成人工抗原時(shí)，可能形成兩種產(chǎn)物，一種是半抗原—蛋白復(fù)合物(即本合成的目的產(chǎn)物——人工抗原)，另一種則是取代脲—蛋白復(fù)合物(圖2—1)。然而，這兩種產(chǎn)物往往是被當(dāng)作均一的人工抗原作為免疫原給動(dòng)物免疫的，但是，實(shí)際上加到載體蛋白分子上的外源性抗原決定族就有兩種，一種是半抗原的，一種是取代脲的，因而，也就可能產(chǎn)生兩種抗體。后一種抗體往往對(duì)半抗原的檢測(cè)專一性和靈敏度有明顯的干擾，使問題復(fù)雜。用第一種碳二亞胺合成半抗原一蛋白結(jié)合物，即用于免疫動(dòng)物的人工抗原(免疫原)；而用第二種碳二亞胺合成的結(jié)合物作為抗體的檢測(cè)抗原，當(dāng)然，兩者也可調(diào)換使用。 可以選用的兩種水溶性碳二亞胺是EDC 和CMC(圖22),其化學(xué)名稱分別為1ethyl—3一(3一dimethyl—aminopropyl)carbodiimide hydrochloride〔1一乙基一3一(3一二甲基氨丙基)碳二亞胺鹽酸鹽，EDC或Ethyl—CDl]和1—cyclohexyl—3—(2—morph0linyl—(4)—ethyl)carodiimide metho—p—t01uenesulfonate〔1—環(huán)己基—3—(2—嗎啉代乙基)—碳二亞胺對(duì)甲苯甲磺酸，CMC或Morpho—CDl]。 以下簡(jiǎn)要介紹EDC法制備人工抗原的操作步驟: 說明：在交聯(lián)過程中，可不加(8)H標(biāo)半抗原，結(jié)合比可用其它方法計(jì)算。(六)親和標(biāo)記法 除上述使用化學(xué)交聯(lián)法制備酶標(biāo)結(jié)合物或人工抗原結(jié)合物以外，近20年來，又出現(xiàn)了生物親和(配體)交聯(lián)法，目前，已廣為采用的有BAS法，SPA法，PHA法和PAP法等。 1．BAS(Biotin—Avidin)法[30]，BAS是利用生物素(Biotin, B)與親和素(Avidin, A)之間具有很強(qiáng)親和力的特性，作為酶對(duì)抗體標(biāo)記的一種通用工具。 生物素又稱維生素H,是生物體內(nèi)羧化酶的輔酶廣泛存在于動(dòng)植物體內(nèi)，特別是存在于蛋黃、肝、腎等組織中的一種小分子生長(zhǎng)因子，分子量為244．31，等電點(diǎn)為pH3．5，分子式為C10H16O5N2S，其結(jié)構(gòu)式為：式中I環(huán)為味唑酮環(huán)，又稱ureido環(huán)，是與親和素結(jié)合的主要部位，II環(huán)是噻吩環(huán),C39。上的側(cè)鏈末端羧基是與酶和抗體標(biāo)記結(jié)合的唯一部位。 親和素亦稱抗生物素蛋白，富含于雞卵清中，是一種分子量為68，000，等電點(diǎn)為pH 10．5的堿性糖蛋白，由四個(gè)相同的亞基組成，其間通過二硫鍵相連接。已經(jīng)知道，在生物素與親和素的相互反應(yīng)中，有很強(qiáng)的親和力(Ka＝10(5)／M)，為抗原抗體反應(yīng)的百萬倍，其結(jié)合后異常穩(wěn)定而不易解離。由于Avidin與Biotin的結(jié)合僅僅發(fā)生奪Biotin的I環(huán)結(jié)構(gòu)部位，而對(duì)Biotin分子中II環(huán)側(cè)鏈之羧基的化學(xué)修飾，在形成具有與生物大分子結(jié)合的反應(yīng)活性基團(tuán)的生物素衍生物時(shí)，此兩過程互不干擾；也就是說，對(duì)Biotin—II環(huán)側(cè)鏈羧基的化學(xué)修飾，及此后與生物大分子(抗體或酶)的結(jié)合，不影響B(tài)iotin通過I環(huán)與Avdin結(jié)合。同時(shí)，由于Avidin的每個(gè)亞基可以均等地結(jié)合一個(gè)Biotin分子，所以，每個(gè)Avidin分子可同時(shí)結(jié)合四個(gè)Biotin分子，因而，親和素本身是一個(gè)多價(jià)分子。這樣，如在同一個(gè)反應(yīng)體系中，有兩種不同的生物素化蛋白(例如抗體或酶)的生物素殘基存在時(shí)，它們則可同時(shí)被親和素分子所接受(或結(jié)合)。 Biotin 活化后具有很高的比活性，一個(gè)蛋白大分子或酶分子可與多個(gè)Biotin分子交聯(lián)或標(biāo)記，使酶或其它標(biāo)記分子成為多價(jià)分子。因此，當(dāng)酶與抗體通過BAS進(jìn)行交聯(lián)時(shí)，便構(gòu)成一個(gè)多級(jí)放大系統(tǒng)[16]。利用Avidin與Biotin之間的獨(dú)特的親和力，以及兩者既可與大分子蛋白(如抗