【正文】 換層析是在以離子交換劑為固定相 ， 液體為流動相的系統(tǒng)中進行的 。 A、 定義： 是利用離子交換劑上的可解離基團 (活性基團 )對溶液中各種離子的結和力不同而達到分離目的的一種層析分離技術 。 離子交換層析 1 2 3 4 5 原始緩沖溶液的反離子 樣品溶液 梯度濃度 段 :離子交換劑與反離子結合 段：樣品與反離子進行交換 4. 解吸附階段：用梯度緩沖溶液洗脫，先洗下弱吸附物質，后洗下強吸附物質 ：用原始平衡液進行充分洗滌，既可重復使用 B、離子交換劑 母體 ： 不溶性高分子。如纖維素、凝膠、樹脂。瓊脂糖、葡聚糖等 可解離基團 ： 酸性基團： SO3H（ SE強酸型）、–COOH（ CM弱酸型）也稱 陽離子交換劑 堿性基團： NH2 （ AE，弱堿型）， N（ CH3 ） 2 （ DEAE）， N+（ CH3） 3（強堿型）、也稱陰離子交換劑 陽離子交換劑 陽離子交換劑的電荷基團帶負電 ， 反離子帶正電 。 如磺酸基 (一 S03H)， 磷酸基 (一 P03H)， 亞磷酸基 (一 PO2H)， 羧基 (一 COOH)， 酚羥基 (一 OH)等 。 引入酸性基團的交換劑可離解出 H+， 可以與溶液中的正電荷化合物或陽離子進行交換反應 。 根據(jù)電荷基團的強弱 ， 又可將陽離子交換劑分為強酸型 (帶磺酸基團 )、 中強酸型 (帶磷酸基團或亞磷酸基團 )和弱酸型 (帶羧基或酚基 )三種 。 R—AH+Na+ = R—ANa+H+ 陰離子交換劑 陰離子交換劑是在樹脂中分別引入季胺 [一N+(CH3)3]、 叔胺 [一 N(CH3)2]、 仲胺 [一 NHCH3]和伯胺 [一 NH2]基團構成的 。 當引入季胺和叔胺基團時 ，分別為強陰性和中強陰性離子交換劑 。 當引入仲胺和伯胺基團時 ， 為弱陰性離子交換劑 。 引入含氨基堿性基團的交換劑 ， 可與 OH—結合后 ，與其他陰離子交換 ， 屬于陰離子交換劑 。 R一 N+(CH3)30H一 十 C1— = R—N十 (CH3)3C1— +OH— ? 為了使蛋白質從離子交換柱上洗脫下，需要降低它們之間的親和力，有效的方法是逐步 提高洗脫劑的 pH和 鹽濃度 (離子強度 )， 這樣各種蛋白質將以不同的速度被洗脫下來。 離子交換層析及洗脫 ? (1) 采用保持洗脫液成分一直不變的方式洗脫， ? (2) 采用改變洗脫的鹽濃度或 pH的方式洗脫，又可以分為兩種： ? 一種是跳躍式的 分段洗脫 ? 另一種是漸進式的 梯度洗脫 。一般分離效果好，分辨率高，特別是使用交換容量小，對鹽濃度敏感的離子交換劑，多采用梯度洗脫。 梯度洗脫的類型 ? 通常采用的梯度形式有 線性 (形 )，凸形，凹形和復合形 四種，使用最多的是線性梯度。為獲得這些梯度設計出多種梯度混合器 K=(CR— CM) / V 第六節(jié) 蛋白質的含量測定 與純度鑒定 一、蛋白質含量測定 ? 目前總蛋白質含量測定有兩類方法 ， ? 一類是利用蛋白質的 物理性質 ， 如折射率 、比重 、 紫外吸收等測定得知 ， ? 另一類是利用 化學方法 測定蛋白質含量 ， 如微量凱氏定氮 、 雙縮脲反應 、 Folin酚試劑法 (又名 Lowry法 )。 ? 這兩類方法各有優(yōu)缺點 ， 選用何種方法測定蛋白質含量 ， 可根據(jù)實驗要求及實驗室條件進行選擇 。 原理都是利用蛋白質的成色反應或紫外吸收的性質 ， 通過分光光度法來測定 。 1. 凱氏定氮法 ? 是經典的標準方法，用濃硫酸消化蛋白質分解出氨，測定氨的含量，除以16%，就得出蛋白質的含量。 2. 雙縮脲法 ? 蛋白質在堿性溶液中，能與 Cu2+形成紫紅色絡合物，顏色深淺與蛋白質濃度成正比，故可以用來測定蛋白質的濃度。 ? 凡含有雙縮脲相似結構的物質均能參與反應，常用于需要快速但并不需要十分精確的測定。 3. Lowry法 (Folin酚法 ) ? Folin酚試劑由甲試劑與乙試劑組成 。 ? 甲試劑 由碳酸鈉 、 氫氧化鈉 、 硫酸銅及酒石酸鉀鈉組成 。 相當于雙縮脲試劑 。 ? 乙試劑 是由磷鉬酸和磷鎢酸 、 硫酸 、 溴等組成 。 在堿性條件下極不穩(wěn)定 ， 易被酚類化合物還原而呈藍色反應 （ 鉬藍和鎢藍混合物 ） ， 蛋白質中含有帶酚基的酪氨酸 ， 故有此反應 。 ? 因此 Folin酚法測定蛋白質含量靈敏度較高 。 ? 目前實驗室多用 Folin酚法測定蛋白質含量。 ? 此法的優(yōu)點是操作簡單 ， 迅速 ， 不需特殊儀器設備 ， 靈敏度高 ， 較紫外吸收法靈敏 10—20 倍，較雙縮脲法靈敏 100倍，反應約在 15min內有最大顯色，并至少可穩(wěn)定幾小時。其不足之處是此反應受多種因素干擾。在測試時應排除干擾因素或做空白試驗消除。 4. 紫外吸收法 ? 由于蛋白質分子中酪氨酸和色氨酸殘基的苯環(huán)含有共軛雙鍵，因此蛋白質具有吸收紫外線的性質，吸收高峰在 280nm波長處。在此波長范圍內，蛋白質溶液的光吸收值 (A280)與其含量呈正比關系，可用作定量測定。 紫外吸收法的優(yōu)缺點： ? 優(yōu)點： 簡便 、 不消耗樣品 ， 低濃度鹽類不干擾測定 。 因此 ， 在蛋白質和酶的生化制備中 (特別是在柱層析分離中 )廣泛應用 。 ? 缺點： ? (1) 對于測定那些與標準蛋白質中酪氨酸和色氨酸含量差異較大的蛋白質 ， 有一定的誤差 ， ? (2) 若樣品中含有嘌呤 、 嘧啶等吸收紫外線的物質 ， 會出現(xiàn)較大的干擾 。 5. 考馬斯亮藍染色法 ? 蛋白質的存在，會影響酸堿滴定中所用某些指示劑的顏色變化，從而改變這些染料的光吸收。在此基礎上，發(fā)展蛋白質染色測定方法。 ? 涉及的指示劑有甲基橙、考馬斯亮藍、溴甲酚綠和溴甲酚紫，目前廣泛使用的染料是考馬斯亮藍。 ? 考馬斯亮藍 R250和蛋白質通過范德華鍵結合 ， 呈藍色 ， 在一定蛋白質濃度范圍內 ， 蛋白質的染色符合比爾定律 。 2—5min即呈現(xiàn)最大光吸收 ， 至少穩(wěn)定 1h。 ? 本方法可允許的測定范圍是 2—20ug蛋白質。受蛋白質的特異性影響較小，除組蛋白外，其他不同種類蛋白質的染色強度差別不大。 6. 膠體金測定法 ? 膠體金 是一種帶負電荷的疏水膠體，呈洋紅色，遇蛋白質轉變?yōu)樗{色，顏色改變與蛋白質有定量關系，是幾種方法中靈敏度最高的，檢測量是 ng水平。 7. 某一特定蛋白質的含量測定 ? 通常要用具有高度特異性的生物學方法。 ? 具有酶或激素性質的蛋白質可以利用它們的 酶活性或激素活性 來測定含量。 ? 有些蛋白質雖然沒有酶或激素那樣特異的生物學活性，但是大多數(shù)蛋白質當注入適當?shù)膭游镅褐袝r，會產生抗體。因此， 利用抗體 —抗原反應 ，也可以測定某一特定蛋白質的含量。 二、蛋白質純度的鑒定 ? 蛋白質純度鑒定通常采用物理化學的方法： ? （ 1）電泳： 目前采用的電泳分析有等電聚集、聚丙烯酰胺凝膠電泳 (PAGE)和 SDS—PAGE、毛細管電泳等。純的蛋白質在一系列不同的pH條件下進行電泳時，都將以單一的速度移動，它的電泳圖譜只呈現(xiàn)一個條帶 (或峰 )。 ? （ 2）離心沉降： 純的蛋白質在離心場中，應以單一的沉降速度移動 二、蛋白質純度的鑒定 ? （ 3） HPLC： 常用于多肽、蛋白質純度的鑒定。純蛋白質樣品在 HPLC的洗脫圖譜上呈現(xiàn)出單一的對稱峰。 ? （ 4）溶解度分析： ? （ 5） N—末端分析 也用于鑒定純度，因為均一的單鏈蛋白質樣品中， N端殘基只可能有一種氨基酸。 （ 6）酶的純度的鑒定 ? 純化程度： 通常用這一特定成分的含量(一般用活力單位 )與總蛋白量（重量單位）之比來表示。 ? 對酶來說常以每毫克蛋白所含活力單位數(shù)表示，稱為 酶比活或比活力 。純化工作一直要進行到這個比活不再增加為止 ? * 酶活性單位 定義為在標準實驗條件下催化產生 1mol產物 /min所需的酶量。