【正文】 換層析是在以離子交換劑為固定相 ， 液體為流動相的系統(tǒng)中進(jìn)行的 。 A、 定義： 是利用離子交換劑上的可解離基團(tuán) (活性基團(tuán) )對溶液中各種離子的結(jié)和力不同而達(dá)到分離目的的一種層析分離技術(shù) 。 離子交換層析 1 2 3 4 5 原始緩沖溶液的反離子 樣品溶液 梯度濃度 段 :離子交換劑與反離子結(jié)合 段：樣品與反離子進(jìn)行交換 4. 解吸附階段：用梯度緩沖溶液洗脫，先洗下弱吸附物質(zhì)，后洗下強(qiáng)吸附物質(zhì) ：用原始平衡液進(jìn)行充分洗滌，既可重復(fù)使用 B、離子交換劑 母體 ： 不溶性高分子。如纖維素、凝膠、樹脂。瓊脂糖、葡聚糖等 可解離基團(tuán) ： 酸性基團(tuán)： SO3H（ SE強(qiáng)酸型）、–COOH（ CM弱酸型）也稱 陽離子交換劑 堿性基團(tuán)： NH2 （ AE，弱堿型）， N（ CH3 ） 2 （ DEAE）， N+（ CH3） 3（強(qiáng)堿型）、也稱陰離子交換劑 陽離子交換劑 陽離子交換劑的電荷基團(tuán)帶負(fù)電 ， 反離子帶正電 。 如磺酸基 (一 S03H)， 磷酸基 (一 P03H)， 亞磷酸基 (一 PO2H)， 羧基 (一 COOH)， 酚羥基 (一 OH)等 。 引入酸性基團(tuán)的交換劑可離解出 H+， 可以與溶液中的正電荷化合物或陽離子進(jìn)行交換反應(yīng) 。 根據(jù)電荷基團(tuán)的強(qiáng)弱 ， 又可將陽離子交換劑分為強(qiáng)酸型 (帶磺酸基團(tuán) )、 中強(qiáng)酸型 (帶磷酸基團(tuán)或亞磷酸基團(tuán) )和弱酸型 (帶羧基或酚基 )三種 。 R—AH+Na+ = R—ANa+H+ 陰離子交換劑 陰離子交換劑是在樹脂中分別引入季胺 [一N+(CH3)3]、 叔胺 [一 N(CH3)2]、 仲胺 [一 NHCH3]和伯胺 [一 NH2]基團(tuán)構(gòu)成的 。 當(dāng)引入季胺和叔胺基團(tuán)時(shí) ，分別為強(qiáng)陰性和中強(qiáng)陰性離子交換劑 。 當(dāng)引入仲胺和伯胺基團(tuán)時(shí) ， 為弱陰性離子交換劑 。 引入含氨基堿性基團(tuán)的交換劑 ， 可與 OH—結(jié)合后 ，與其他陰離子交換 ， 屬于陰離子交換劑 。 R一 N+(CH3)30H一 十 C1— = R—N十 (CH3)3C1— +OH— ? 為了使蛋白質(zhì)從離子交換柱上洗脫下，需要降低它們之間的親和力，有效的方法是逐步 提高洗脫劑的 pH和 鹽濃度 (離子強(qiáng)度 )， 這樣各種蛋白質(zhì)將以不同的速度被洗脫下來。 離子交換層析及洗脫 ? (1) 采用保持洗脫液成分一直不變的方式洗脫， ? (2) 采用改變洗脫的鹽濃度或 pH的方式洗脫，又可以分為兩種： ? 一種是跳躍式的 分段洗脫 ? 另一種是漸進(jìn)式的 梯度洗脫 。一般分離效果好，分辨率高，特別是使用交換容量小，對鹽濃度敏感的離子交換劑，多采用梯度洗脫。 梯度洗脫的類型 ? 通常采用的梯度形式有 線性 (形 )，凸形，凹形和復(fù)合形 四種，使用最多的是線性梯度。為獲得這些梯度設(shè)計(jì)出多種梯度混合器 K=(CR— CM) / V 第六節(jié) 蛋白質(zhì)的含量測定 與純度鑒定 一、蛋白質(zhì)含量測定 ? 目前總蛋白質(zhì)含量測定有兩類方法 ， ? 一類是利用蛋白質(zhì)的 物理性質(zhì) ， 如折射率 、比重 、 紫外吸收等測定得知 ， ? 另一類是利用 化學(xué)方法 測定蛋白質(zhì)含量 ， 如微量凱氏定氮 、 雙縮脲反應(yīng) 、 Folin酚試劑法 (又名 Lowry法 )。 ? 這兩類方法各有優(yōu)缺點(diǎn) ， 選用何種方法測定蛋白質(zhì)含量 ， 可根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求及實(shí)驗(yàn)室條件進(jìn)行選擇 。 原理都是利用蛋白質(zhì)的成色反應(yīng)或紫外吸收的性質(zhì) ， 通過分光光度法來測定 。 1. 凱氏定氮法 ? 是經(jīng)典的標(biāo)準(zhǔn)方法，用濃硫酸消化蛋白質(zhì)分解出氨，測定氨的含量，除以16%，就得出蛋白質(zhì)的含量。 2. 雙縮脲法 ? 蛋白質(zhì)在堿性溶液中，能與 Cu2+形成紫紅色絡(luò)合物，顏色深淺與蛋白質(zhì)濃度成正比，故可以用來測定蛋白質(zhì)的濃度。 ? 凡含有雙縮脲相似結(jié)構(gòu)的物質(zhì)均能參與反應(yīng)，常用于需要快速但并不需要十分精確的測定。 3. Lowry法 (Folin酚法 ) ? Folin酚試劑由甲試劑與乙試劑組成 。 ? 甲試劑 由碳酸鈉 、 氫氧化鈉 、 硫酸銅及酒石酸鉀鈉組成 。 相當(dāng)于雙縮脲試劑 。 ? 乙試劑 是由磷鉬酸和磷鎢酸 、 硫酸 、 溴等組成 。 在堿性條件下極不穩(wěn)定 ， 易被酚類化合物還原而呈藍(lán)色反應(yīng) （ 鉬藍(lán)和鎢藍(lán)混合物 ） ， 蛋白質(zhì)中含有帶酚基的酪氨酸 ， 故有此反應(yīng) 。 ? 因此 Folin酚法測定蛋白質(zhì)含量靈敏度較高 。 ? 目前實(shí)驗(yàn)室多用 Folin酚法測定蛋白質(zhì)含量。 ? 此法的優(yōu)點(diǎn)是操作簡單 ， 迅速 ， 不需特殊儀器設(shè)備 ， 靈敏度高 ， 較紫外吸收法靈敏 10—20 倍，較雙縮脲法靈敏 100倍，反應(yīng)約在 15min內(nèi)有最大顯色，并至少可穩(wěn)定幾小時(shí)。其不足之處是此反應(yīng)受多種因素干擾。在測試時(shí)應(yīng)排除干擾因素或做空白試驗(yàn)消除。 4. 紫外吸收法 ? 由于蛋白質(zhì)分子中酪氨酸和色氨酸殘基的苯環(huán)含有共軛雙鍵，因此蛋白質(zhì)具有吸收紫外線的性質(zhì)，吸收高峰在 280nm波長處。在此波長范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)溶液的光吸收值 (A280)與其含量呈正比關(guān)系，可用作定量測定。 紫外吸收法的優(yōu)缺點(diǎn)： ? 優(yōu)點(diǎn)： 簡便 、 不消耗樣品 ， 低濃度鹽類不干擾測定 。 因此 ， 在蛋白質(zhì)和酶的生化制備中 (特別是在柱層析分離中 )廣泛應(yīng)用 。 ? 缺點(diǎn)： ? (1) 對于測定那些與標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)中酪氨酸和色氨酸含量差異較大的蛋白質(zhì) ， 有一定的誤差 ， ? (2) 若樣品中含有嘌呤 、 嘧啶等吸收紫外線的物質(zhì) ， 會出現(xiàn)較大的干擾 。 5. 考馬斯亮藍(lán)染色法 ? 蛋白質(zhì)的存在，會影響酸堿滴定中所用某些指示劑的顏色變化，從而改變這些染料的光吸收。在此基礎(chǔ)上，發(fā)展蛋白質(zhì)染色測定方法。 ? 涉及的指示劑有甲基橙、考馬斯亮藍(lán)、溴甲酚綠和溴甲酚紫，目前廣泛使用的染料是考馬斯亮藍(lán)。 ? 考馬斯亮藍(lán) R250和蛋白質(zhì)通過范德華鍵結(jié)合 ， 呈藍(lán)色 ， 在一定蛋白質(zhì)濃度范圍內(nèi) ， 蛋白質(zhì)的染色符合比爾定律 。 2—5min即呈現(xiàn)最大光吸收 ， 至少穩(wěn)定 1h。 ? 本方法可允許的測定范圍是 2—20ug蛋白質(zhì)。受蛋白質(zhì)的特異性影響較小，除組蛋白外，其他不同種類蛋白質(zhì)的染色強(qiáng)度差別不大。 6. 膠體金測定法 ? 膠體金 是一種帶負(fù)電荷的疏水膠體，呈洋紅色，遇蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)變?yōu)樗{(lán)色，顏色改變與蛋白質(zhì)有定量關(guān)系，是幾種方法中靈敏度最高的，檢測量是 ng水平。 7. 某一特定蛋白質(zhì)的含量測定 ? 通常要用具有高度特異性的生物學(xué)方法。 ? 具有酶或激素性質(zhì)的蛋白質(zhì)可以利用它們的 酶活性或激素活性 來測定含量。 ? 有些蛋白質(zhì)雖然沒有酶或激素那樣特異的生物學(xué)活性，但是大多數(shù)蛋白質(zhì)當(dāng)注入適當(dāng)?shù)膭游镅褐袝r(shí)，會產(chǎn)生抗體。因此， 利用抗體 —抗原反應(yīng) ，也可以測定某一特定蛋白質(zhì)的含量。 二、蛋白質(zhì)純度的鑒定 ? 蛋白質(zhì)純度鑒定通常采用物理化學(xué)的方法： ? （ 1）電泳： 目前采用的電泳分析有等電聚集、聚丙烯酰胺凝膠電泳 (PAGE)和 SDS—PAGE、毛細(xì)管電泳等。純的蛋白質(zhì)在一系列不同的pH條件下進(jìn)行電泳時(shí)，都將以單一的速度移動，它的電泳圖譜只呈現(xiàn)一個(gè)條帶 (或峰 )。 ? （ 2）離心沉降： 純的蛋白質(zhì)在離心場中，應(yīng)以單一的沉降速度移動 二、蛋白質(zhì)純度的鑒定 ? （ 3） HPLC： 常用于多肽、蛋白質(zhì)純度的鑒定。純蛋白質(zhì)樣品在 HPLC的洗脫圖譜上呈現(xiàn)出單一的對稱峰。 ? （ 4）溶解度分析： ? （ 5） N—末端分析 也用于鑒定純度，因?yàn)榫坏膯捂湹鞍踪|(zhì)樣品中， N端殘基只可能有一種氨基酸。 （ 6）酶的純度的鑒定 ? 純化程度： 通常用這一特定成分的含量(一般用活力單位 )與總蛋白量（重量單位）之比來表示。 ? 對酶來說常以每毫克蛋白所含活力單位數(shù)表示，稱為 酶比活或比活力 。純化工作一直要進(jìn)行到這個(gè)比活不再增加為止 ? * 酶活性單位 定義為在標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)條件下催化產(chǎn)生 1mol產(chǎn)物 /min所需的酶量。