蛋白質(zhì)分離純化技術(shù)(存儲版)
【正文】 分離。 ? 對 蛋白質(zhì)、核酸、氨基酸、生物堿、類固醇和類脂 等尤為有利。 作業(yè)： 1997年清華大學(xué)考研題 ? 有兩個純的蛋白質(zhì) a和 b，相對分子質(zhì)量都是100000的近似球形的蛋白質(zhì)。 pH范圍： pH3~10 pH梯度的形成 載體兩性電解質(zhì)是一系列不同分子的兩性電解質(zhì)的混合物 ， 在通電后 ， 它們各自遷移到適當(dāng)位置形成一個連續(xù)的 pH梯度 。 ? 理想的兩性電解質(zhì)載體應(yīng)在 pI處有足夠的緩沖能力及電導(dǎo) ，保證 pH梯度的穩(wěn)定和允許一定的電流通過。 固相化 pH梯度凝膠 (IPG)的優(yōu)點 ? 避免陰極漂移： 因 pH梯度是 共價固定 于凝膠內(nèi)部的，具有更寬的 pH分離范圍，使過酸過堿的蛋白質(zhì)得到分離 ? 具有更高的負載蛋白質(zhì)的能力 ? 生產(chǎn)上重復(fù)性好 雙向電泳 (twodimensional electrophoresis, 2DE) ? 最早是由 Smithies和 Poulik提出，蛋白質(zhì)第一向根據(jù)其 自由遷移率， 在 濾紙條 上進行的；第二向電泳方向與第一向垂直，在 淀粉膠 上進行。 常用的軟件如安瑪西亞公司的 Image Master 2D Elite或 Image Master 2D Planium分析軟件 。 沉降系數(shù) ? 沉降系數(shù)為顆粒在 單位離心力場作用下的沉降速度 ，是 1924年 Svedberg提出的。 如：離心管口 R＝ ，管底 R＝ ， rpm＝ 12022 離心機的分類 ? 目前在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域內(nèi)常用的離心機種類很多，按其 離心轉(zhuǎn)子能達到最高轉(zhuǎn)速 分： ? 低速離心機 (在 6,000 rpm以下 ) ? 高速離心機 (在 25,000 rpm以下 ) ? 超速離心機 (在 30,000 rpm以上 ) 離心分離技術(shù)的種類 ? 差速離心法是指通過不斷 增加相對離心力 ，使沉降速度不同的顆粒，在不同離心速度及不同離心時間下分批離心方法。沉降系數(shù)越大，往下沉降越快，所呈的區(qū)帶也越低。 溶解度恒定法 加入樣品量為橫坐標(biāo)，樣品溶解量為縱坐標(biāo)，作 圖。 ? 消化后，在凱氏定氮儀中加入 強堿 堿化消化液，使硫酸銨分解，放出氨 。此外，不同蛋白質(zhì)因酪氨酸、色氨酸含量不同而使顯色強度稍有不同 蛋白質(zhì)的紫外吸收 ? 蛋白質(zhì)分子中， 酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸 殘基的苯環(huán)含有 共軛雙鍵 ，使蛋白質(zhì)具有吸收紫外光的性質(zhì)。這一方法是目前靈敏度最高的蛋白質(zhì)測定法。 。 在 595nm下測定的吸光度值 A595， 與蛋白質(zhì)濃度成正比 。 特 點 ? 此法操作 簡便，靈敏度比雙縮脲法高 100 倍 ，定量范圍為 5～ 100μg蛋白質(zhì)。當(dāng)天然含氮有機物與 濃硫酸 共熱，分解出 碳、氫、氮形成二氧化碳、水及氨 ，產(chǎn)生的氨能夠與 硫酸 結(jié)合，生成硫酸銨，此過程稱為 “消化” 。 ? 超速： 50000120220rpm 蛋白質(zhì)純度的鑒定 各種細分級的方法都可以用于純度鑒定 常用各種電泳法 ，比較權(quán)威的有：等速電泳、梯度電泳、等電聚焦電泳、 聚丙烯酰胺凝膠電泳。 速度區(qū)帶離心法 ? 在 離心前離心管內(nèi)預(yù)先裝入密度梯度介質(zhì) (如蔗糖、甘油、 KBr、 CsCl等 )，待分離的樣品鋪在梯度液的頂部或梯度層中間，同梯度液一起離心。計算顆粒的相對離心力時，應(yīng)注意離心管與旋轉(zhuǎn)中心的 距離 R。每個顆粒都有一定 大小、形狀、密度和質(zhì)量 。商品化的IPG strips可以從 Amersham Pharmacia公司或 BioRad公司購買。 IEFE的改進 ? 1982年， Bjellqvist等提出了 固相化 pH梯度（ immobilized pH gradients, IPG） ? 方法： 通過在灌膠時將丙烯酰胺緩沖液中加到聚丙烯酰胺凝膠中來產(chǎn)生 pH梯度。 載體兩性電解質(zhì)（ ampholyte，商品名為 ampholine） ? 早期的 IFE方法用的是 載體兩性電解質(zhì) pH梯度聚丙烯酰胺管狀膠 。 原 理 ? 等電聚焦 就是在電泳介質(zhì)中放入 載體兩性電解質(zhì) ，當(dāng)通以直流電時，兩性電解質(zhì)即形成一個由陽極到陰極逐步增加的 pH梯度 ，在此體系中，不同的蛋白質(zhì)即移動到或聚焦于其相當(dāng)?shù)牡入婞c位置上 ，也就是說被聚焦于一個狹的區(qū)帶中，電泳技術(shù)中的等電點聚焦也稱為聚焦電泳。該法主要利用了 蛋白質(zhì)分子量大小不同而分離蛋白質(zhì) 。 凝膠色譜： （分子排阻色譜法 ） 凝膠色譜分離機理 HPLC的 特點 ? 具有氣相層析的全部優(yōu)點。 飽和烴 烯 芳烴 醚 醛酮 酸 液固吸附色譜分離機理 分離過程是一個吸附 —— 脫附的平衡過程。 液相色譜 (liquid chromatograph, LC) ? LC同樣可分為 液固色譜法 (LSC)和 液液色譜法(LLC)。例如，用毛細管，可以分析輕油中 150個組份。 含配體溶液 收集目的蛋白 洗下未結(jié)合的蛋白 混合蛋白樣品 平衡液 帶有配體的樹脂珠（或膠粒） 優(yōu) 點 ? 親和層析純化 過程簡單 、 迅速 ，且 分離效率高 。 帶有 SO3－ 或 COO－ 基團 ， 通常以 SO3－ Na＋ 或COO－ H＋ 形式出現(xiàn)的叫做 陽離子交換基 ； 帶有 N＋ (C2H5)基團通常以 N＋ (C2H5) Cl－ 出現(xiàn)的叫做 陰離子交換基 。 聚丙烯酰胺凝膠 選擇何種凝膠以及它的型號 ， 這需要 根據(jù)實驗條件 ， 溶質(zhì)的分子量大小和分離工作的目的而定 ， 每種型號凝膠都有一定分離溶質(zhì)分子量的范圍 ， 選擇的型號凝膠要能 滿足實驗要求 。 OH 葡聚糖凝膠（商品名為 Sephadex） Sephadex的三維空間網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的網(wǎng)孔大小取決于交聯(lián)度 ， 交聯(lián)度的大小可在合成 Sephadex時控制加入交聯(lián)劑的百分比決定 。 ， 重復(fù)性好 。 層析柱 中的填料是某些惰性的多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)物質(zhì)，多是交聯(lián)的聚糖(如葡聚糖或瓊脂糖 )類物質(zhì)，凝膠顆粒在合適的溶劑中浸泡，充分吸脹后裝入色譜柱內(nèi)，加入欲分離的混合物后，再以同一溶劑洗脫。 ? 大多數(shù)蛋白質(zhì)在低溫下比較穩(wěn)定，因此蛋白質(zhì)的分級分離操作一般都在 0℃ 或更低的溫度下進行。 透析 —— 只用來除鹽類和小分子雜質(zhì) 超過濾 （ ultrafiltration） 加壓 蛋白質(zhì)溶液 半透膜 支持膜的柵板 超濾液 原理 :是利用壓力或離心力，強行使水和其他小分子溶質(zhì)通過半透膜，而蛋白質(zhì)留在半透膜上，以達到濃縮和脫鹽的目的 鹽析 (salt precipitation) 原理： 將硫酸銨 、 硫酸鈉或氯化鈉等加入蛋白質(zhì)溶液 ， 使蛋白質(zhì) 表面電荷被中和以及水化膜被破壞 ， 導(dǎo)致蛋白質(zhì)沉淀 。 ? 蛋白質(zhì)膠體穩(wěn)定的因素 ? 顆粒表面電荷（雙電層） ? 水化膜
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