蛋白質(zhì)的分離純化概要-在線瀏覽
2024-11-04 05:31本頁(yè)面
【正文】 qǔ),組織細(xì)胞破碎過(guò)程中，大量(d224。ng)的胞內(nèi)酶及細(xì)胞內(nèi)含物被釋放出來(lái)，必須立即將其置于一定條件下和溶劑中，讓制備物充分溶解，并盡可能保持原來(lái)的天然狀態(tài)，防止因長(zhǎng)久放置造成制備物的分解破壞，這就是提取。,蛋白質(zhì)的提取(t237。通常采用類(lèi)似生理?xiàng)l件下的緩沖液，如2050m mol/L的磷酸鹽緩沖液〔pH7.07.5〕或0.1mol/L TrisHCl〔pH7.58.0〕緩沖液作提取液。,第十頁(yè)，共六十一頁(yè)。)純化,從細(xì)胞中提取得到的蛋白質(zhì)往往是不純(b249。n)的，含有大量雜質(zhì)，必須進(jìn)一步別離純化，這一階段可分為粗分級(jí)別離和細(xì)分級(jí)別離兩步進(jìn)行。,一、蛋白質(zhì)的別離(fēnl237。 性質(zhì) 方法 分子大小 透析、超濾、密度梯度離心(l237。,主要是利用鹽析法、等電點(diǎn)沉淀、有機(jī)溶劑沉淀等方法，使目的蛋白與其它較大量的雜蛋白分開(kāi)(fēn kāi)，這些方法的特點(diǎn)是簡(jiǎn)便、處理量大、既能除去大量雜質(zhì)，又能濃縮蛋白質(zhì)，但分辨率低。,〔1〕鹽析(y225。ngy232。 鹽析作用是由于當(dāng)鹽濃度較高時(shí)，鹽離子與水分子作用，使水的活度降低，原來(lái)溶液中大局部的自由水轉(zhuǎn)變?yōu)辂}離子的水化水，從而降低蛋白質(zhì)極性基團(tuán)與水分子之間的作用，破壞蛋白質(zhì)分子外表的水化層，使蛋白聚集沉淀。,第十四頁(yè)，共六十一頁(yè)。n)的極性基團(tuán)的種類(lèi)、數(shù)目以及排布的不同，其水化層厚度不同，故鹽析所需要的鹽濃度也不一樣，因此調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的中鹽濃度，可以使不同的蛋白質(zhì)分別沉淀。qīng),球蛋白,清蛋白(d224。i),(NH4)2SO4,50%飽和度,100%飽和,析出,析出,分段鹽析,第十五頁(yè)，共六十一頁(yè)。ndi224。在溶液pH值等于蛋白質(zhì)等電點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)的溶解度最小。,第十六頁(yè)，共六十一頁(yè)。ngdī)。 是極性有機(jī)溶劑與蛋白質(zhì)爭(zhēng)奪水化水，而使蛋白質(zhì)分子沉淀。,室溫下，這些有機(jī)溶劑不僅能使蛋白質(zhì)沉淀，而且伴隨著變性。 不同的蛋白質(zhì)由于水化層厚度不同，發(fā)生沉淀需要(xūy224。,第十八頁(yè)，共六十一頁(yè)。ngpǐn)經(jīng)粗制分級(jí)后，體積較小，雜質(zhì)大局部被除去。 常用的柱層析方法有分子篩層析、離子交換層析、疏水吸附層析、親和層析。 另外，結(jié)晶也是蛋白質(zhì)別離純化的方法之一，制備的結(jié)晶物常常作為蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析之用。,酶的活力(hu243。)測(cè)定,在酶的制備過(guò)程中，每一步驟(b249。u)都應(yīng)測(cè)定留用以及準(zhǔn)備棄去局部中所含酶的總活力和比活力，以了解經(jīng)過(guò)某一步驟(b249。u)后酶的回收率、純化倍數(shù)，從而決定這一步的取舍。,第四節(jié) 蛋白質(zhì)純度(ch)鑒定,生物大分子經(jīng)過(guò)別離提純，最后還要鑒定制品的純度。nji224。 純的蛋白質(zhì)在一定條件下進(jìn)行電泳，將以單一的速度移動(dòng)，它的電泳圖譜只出現(xiàn)一條帶。 選用任何單獨(dú)一種鑒定方法都不能最后確定蛋白質(zhì)的純度，必須同時(shí)采用23種不同的方法才能確定。,第五節(jié) 蛋白質(zhì)的層析別離,應(yīng)用廣泛。)固定相和一個(gè)(yī ɡ232。由于待別離的各種物質(zhì)在這兩個(gè)相分配系數(shù)不同，當(dāng)兩個(gè)相作相對(duì)運(yùn)動(dòng)時(shí)，這些物質(zhì)在兩相間反復(fù)屢次分配，結(jié)果使其相互分開(kāi)。按操作形式分為：柱層析、薄層層析、紙層析等。,第二十三頁(yè)，共六十一頁(yè)。質(zhì)量分配系數(shù)：D=kVs / Vm , Vs , Vm 為固定相和流動(dòng)相的體積。經(jīng)過(guò)5層的平衡(p237。ng)分配后，樣品在柱的分配情況見(jiàn)圖。如果D1，樣品集中在中間偏下。,離子交換(l237。n)層析(IEX)是根據(jù)電荷來(lái)別離分子的。分為： 陽(yáng)離子交換劑: 解離基團(tuán)帶負(fù)電, 結(jié)合陽(yáng)離子。 蛋白質(zhì)分子是兩性物質(zhì)。如陽(yáng)離子交換劑與帶正電蛋白質(zhì)分子之間有如下平衡：,二、離子交換(l237。n)層析,〔一〕根本原理,第二十五頁(yè)，共六十一頁(yè)。 由于pH可改變蛋白質(zhì)的帶電性質(zhì)和帶電量，鹽離子會(huì)影響蛋白質(zhì)在交換劑上吸附。對(duì)多組分混合物，每種分子所帶的電荷不同，因此，可用不同的離子強(qiáng)度 或不同的pH溶液將蛋白質(zhì)從交換劑上一一洗脫下來(lái)。,〔二〕離子交換劑的根本(jīběn)類(lèi)型,根據(jù)可供交換的離子的性質(zhì)，離子交換劑可被分為陽(yáng)離子交換劑和陰離子交換劑。 suān)、弱堿幾種類(lèi)型的離子交換劑。弱酸型交換劑在低于pH弱堿型交換劑在高于pH9就難于解離，因而失去交換能力
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