蛋白質(zhì)分離純化技術(shù)-文庫吧在線文庫
【正文】 蛋白質(zhì)分離純化的一般原則 ? 總目標(biāo)：增加蛋白制品的 純度 或 比活 ? (pretreatment)： 因動 /植物 /細菌而異 ? (rough fractionation)： 采用鹽析 /等電點沉淀 /有機溶劑分級分離等方法 ? (fine frationation)： 采用凝膠過濾、離子交換層析、吸附層析以及親和層析等 ? ：分離純化的最后步驟 蛋白質(zhì)的分離純化方法 根據(jù)蛋白質(zhì)分子大小的差異分離 — 透析和超濾 根據(jù)蛋白質(zhì)的溶解度差異分離 — 沉淀、鹽析等 根據(jù)蛋白質(zhì)的電荷差異分離 — 電泳、離子交換等 根據(jù)蛋白質(zhì)與某些物質(zhì)的吸附差異 — 吸附分離 利用生物分子專一性結(jié)合的特性 — 親和層析 透析（ dialysis） 原理： 利用 蛋白質(zhì)分子不能通過半透 而將其與小分子物質(zhì)分開 常用的半透膜為 玻璃紙 或 纖維素材料 按照 分子大小 進行分離，分離取決于透析袋截留的分子量。在 40~50℃ 以上，大部分蛋白質(zhì)變得不穩(wěn)定并開始變性，一般在中性 pH介質(zhì)中即失去溶解力。其機理是分子篩效應(yīng)，主要根據(jù)蛋白質(zhì)分子的 大小 進行分離和純化。 操作條件較溫和 ， 不易引起生物物質(zhì)的變性 ， 即使用來分離一些理化性質(zhì)不穩(wěn)定的物質(zhì)也很少被破壞 。 常用分子篩： 葡聚糖凝膠（ Sephadex） 型號： G200、 G150、 G100、 G7 G50、 G2 G15 分離大蛋白質(zhì) 小蛋白質(zhì) 除鹽 瓊脂糖凝膠 （瑞典 Sepharose、美國 BioGelA） 孔徑大，用于分離大分子物質(zhì) 聚丙烯酰胺凝膠 （ BioGelP） 結(jié)構(gòu)：葡聚糖用交聯(lián)劑 1氯 2,3環(huán)丙烷使葡聚糖之間通過醚鍵 (COCH2CHCH2O)交聯(lián)聚合而成的 三維空間網(wǎng)狀結(jié)構(gòu) 。 瓊脂糖凝膠（商品名為 Sepharose) 使用 范圍及效果 同葡聚糖凝膠相似 ， 但化學(xué)性質(zhì)較葡聚糖穩(wěn)定 ， 可在 pH 211范圍內(nèi)使用 . 聚丙烯酰胺凝膠的商品為生物膠 P（ BioGel P） ， 由美國 BioRod廠生產(chǎn) ， 型號很多 ，從 P2至 P300共 10種 ， P后面的數(shù)字再乘 1000就相當(dāng)于該凝膠的排阻限度 。 離子交換層析的固相是 離子交換體 ， 包括 離子交換樹脂 、 離子交換纖維素 、 離子交換葡聚糖 。 原 理 親和層析過程 吸附本質(zhì) ：非共價連接 常用吸附劑 ：結(jié)晶磷酸鈣、硅膠等 脫附（洗脫）方式： 改變蛋白質(zhì)帶電狀態(tài)； 改變環(huán)境溶液的 pH、離子強度等。 當(dāng)層析系統(tǒng)的流動相為氣體如氫、氦、氮，固相為涂漬在固體顆粒表面的液體時，此層析技術(shù)稱為氣液層析或氣液色譜 氣相色譜法的特點 應(yīng)用范圍廣 ： 氣象色譜法可以分析氣體和易揮發(fā)的物質(zhì) 高效： 可以分析沸點十分相近的組分，和極為復(fù)雜的多組份混合物。色譜法易于自動化．操作與處理都自動化，速度很快。 極性較大組分滯留作用大，后流出。 ? 常用于分離 高分子化合物 ，如組織提取物、多肽、蛋白質(zhì)、核酸等。 ? 每一個蛋白質(zhì)分子都因為結(jié)合了許多的 SDS而帶有大量的負電荷，而蛋白質(zhì)分子原有的電荷則可以忽略。 pH梯度是以兩性電解質(zhì) 在外電場作用下自然形成。 電泳結(jié)束后的變化 所有的載體兩性電解質(zhì)分子以增加 pI級數(shù)的辦法將分別在陽、陰極之間到達它們自己的位置而給出一個pI梯度 。 ? 軟的丙烯酰胺管膠的 操作非常困難 ，因為膠容易被伸長或斷裂，引起分離結(jié)果之間的變化。 2DE儀器系統(tǒng) 恒溫水浴 垂直板電泳儀（第二向） 電源 等電聚焦儀（第一向） ?目前，第一向等電聚焦電泳普遍采用 預(yù)制的固定 pH梯度膠條 (immobilized pH gradient strips, IPG strips)。 離心技術(shù)的原理 ? 將處于懸浮狀態(tài)的細胞、細胞器、病毒和生物大分子等稱為 “ 顆粒 ” 。一般情況下，低速離心時常以 rpm來表示，超速離心則以 g表示 。后者又可分為預(yù)制梯度等密度及自形成梯度等密度兩種方法。 CsCl密度梯度離心 超速離心 ? 超速離心法 (ultracentrifugation)既可以用來分離純化蛋白質(zhì)，也可以用作測定蛋白質(zhì)的分子量。 滲透壓法 超離心法 凝膠過濾法 SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳 蛋白質(zhì)含量的測定 凱氏定氮法 雙縮脲反應(yīng) Folin酚試劑反應(yīng) 紫外吸收法 考馬斯亮藍法 凱氏定氮法 ? 是一種檢測物質(zhì)中 “含氮總量” 的方法。同樣需做標(biāo)準(zhǔn)曲線。經(jīng)研究認為，染料主要是與蛋白質(zhì)中的 堿性氨基酸 （特別是精氨酸）和 芳香族氨基酸殘基 相結(jié)合。 ? （ 3）標(biāo)準(zhǔn)曲線也有輕微的非線性，因而不能用 Beer定律進行計算，而 只能用標(biāo)準(zhǔn)曲線 來測定未知蛋白質(zhì)的濃度。 ? （ 1）靈敏度高 ? （ 2）測定快速、簡便，只需加一種試劑。吸收高峰在 280nm處，其吸光度（即光密度值）與蛋白質(zhì)含量成 正比 。用 水蒸汽蒸餾法 ，將氨蒸入過量標(biāo)準(zhǔn)無機酸 （硼酸） 溶液中，然后用 標(biāo)準(zhǔn)堿溶液進行滴定 ，準(zhǔn)確測定氨量，從而折算出含氮量。如只有一個拐點則說明樣品純。沉降系數(shù)較小的顆粒，則在較上部分依次出現(xiàn)。 差速離心法一般用于分離沉降系數(shù)相差較大的顆粒 。沉降系數(shù)的物理意義是 顆粒在離心力作用下從靜止?fàn)顟B(tài)到達極限速度所經(jīng)過的時間 。 圖像分析 ?在用雙向電泳進行差別表達蛋白質(zhì)組分析時，需要 利用軟件對產(chǎn)生的 2D膠進行差別分析 ，以尋找差別表達蛋白。 ? 隨著 聚丙烯酰胺凝膠的 發(fā)明，雙向電泳支持介質(zhì)逐漸轉(zhuǎn)向聚丙烯酰胺凝膠，即 雙向凝膠電泳 。 載體兩性電解質(zhì)的局限性 ? 不是明確定義上的分子混合物。 所有的載體兩性電解質(zhì)分子都帶電荷，只是溶液中正電荷和負電荷的基團數(shù)目相等，凈電荷為零。 ? 其中，蛋白質(zhì) a： 由 2個相對分子質(zhì)量為 40000的亞基和 2個相對分子質(zhì)量為 10000的亞基組成的四聚體，該蛋白質(zhì)的等電點 pI=。 電 泳 ? 蛋白質(zhì)在高于或低于其 pI的溶液中為帶電的顆粒，在電場中能向正極或負極移動。 ?分析物質(zhì) 有機酸、氨基酸、多肽及核酸。這是近二十年內(nèi)發(fā)展起來的一項 快速、靈敏、高效 的分離技術(shù)。 高靈敏度： 指用高靈敏度的檢測器可檢測出 1011－ 1013克的物質(zhì)。 分配層析 ? 柱層析 ? 紙層析 ? 薄層層析 氣相色譜 (gas chromatograph, GC
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