【正文】 各種雙水相系統 聚合物 P 聚合物 Q或鹽 聚丙二醇 甲基聚丙二醇，聚乙二醇，聚乙烯醇，聚乙烯吡咯烷酮，羥丙基葡聚糖，葡聚糖 聚乙二醇 聚乙烯醇，葡聚糖，聚蔗糖 甲基纖維素 羥甲基葡聚糖，葡聚糖 乙基羥乙基纖維素 葡聚糖 羥丙基葡聚糖 葡聚糖 聚蔗糖 葡聚糖 聚乙二醇 硫酸鎂，硫酸銨，硫酸鈉，甲酸鈉，酒石酸鉀鈉 圖 4－ 7 雙水相系統相圖 在雙節(jié)線 TCB下方區(qū)域是單相區(qū)，上方是雙相區(qū)。 T點和 B點分別表示達到平衡時的上相組成和下相組成，在同一直線上的各點分成的兩相，具有相同的組成，但體積比不同 當系線 TMB下移，長度減小，兩相之間的差別逐漸減小，達到臨界點C點時，系線長度為零，達到均相。 聚合物 P% B180。 T B C T180。 聚合物Q或鹽% M 雙節(jié)線的位置和形狀與聚合物的分子質量有關，聚合物分子質量越高，相分離所需的濃度越低。 在高分子聚合物上引入親和配基，可以進行雙水相親和萃取 雙水相萃取不足： 分離后酶液濃度低 高分子聚合物在分離后需要分離除去 超臨界萃取 超臨界萃取 又稱超臨界流體萃取，是利用 欲分離物質與雜質在超臨界流體中的溶解度不同 而達到分離的一種萃取技術 在相同的壓力和溫度條件下，同一物質的液相和氣相的物理特性是截然不同的。當溫度和壓力達到某一特定的數值時，氣體和液體的物理特性就會趨于相同，這個數值稱為 超臨界點 。 當溫度和壓力超過其超臨界點時，兩相變?yōu)橐幌?，這種狀態(tài)下的流體稱為 超臨界流體 p T G L S SCF 圖 48 超臨界系統相 超臨界流體的顯著特點： ① 其 物理特性和傳質特性介于液體和氣體之間，適于作萃取溶劑； ② 其具有和液體同樣的溶解能力，具有 很高的萃取速度 ； ③ 隨溫度和壓力變化，其對物質的萃取具有選擇性，萃取后易分離 ； ④ 其黏度接近于氣體的黏度， 利于物質的擴散 ； 作為萃取劑的超臨界流體必須具備以下條件 ： 1. 具備良好的化學穩(wěn)定性，對設備沒腐蝕性； 2. 臨界溫度不能太高或太低，最好在室溫或操作溫度附近； 3. 操作溫度應低于被萃取溶質的分解溫度； 4. 臨界壓力不能太高，節(jié)約壓縮動力； 5. 選擇性要好，容易制得高純度制品； 6. 溶解度要高，可減少溶劑的循環(huán)量； 7. 萃取劑要容易獲得，價格便宜 CO2超臨界萃取的工藝工程由萃取和分離兩個步驟組成，按分離方法不同，分離工藝過程分為： ? 等壓分離：壓力相同，溫度升高，溶質在 CO2中溶解度降低而分離析出分離 ? 等溫分離：溫度相同，壓力下降，溶質在 CO2中溶解度降低而分離析出 ? 吸附分離：溫度壓力不變，分離罐中的吸附劑吸附溶質而分離溶質 在超臨界流體萃取中，為提高分離效果，在超臨界流體中添加少量的另一溶劑，稱為 夾帶劑 ，如水、乙醇、丙酮。 某些超臨界流體的超臨界點和超臨界密度 流體名稱 臨界溫度 (℃) 臨界壓力 (Mpa) 臨界密度 （ g/ml） 乙烷 C2H6 丙烷 C3H8 丁烷 C4H10 戊烷 C5H12 乙烯 C2H4 氨 NH3 二氧化碳 CO2 二氧化硫 SO2 水 H2O 笑氣 N2O 氟里昂 C 反膠束萃取 反膠束萃取是利用反膠束將酶或蛋白從混合液中萃取出來的一種分離純化技術，更具有選擇性。 反膠束是超過臨界膠束濃度的表面活性劑分散于連續(xù)有機相中形成的納米尺度的一種聚集體。 反膠束中，表面活性劑的非極性基團在外，與非極性有機溶劑接觸，而極性基團排列在內，形成一個極性核，極性核具有溶解極性物質的能力，極性核溶解水后，形成水池。當含有此種反膠束的有機溶劑與蛋白質的水溶液接觸后，蛋白質及其它親水物質能夠進入此水池中，酶不會造成失活。 反膠束萃取中，首先要選擇適宜的表面活性劑（常用陰離子表面活性劑 AOT）和有機溶劑 此外，反膠束萃取還受下列因素影響： （ 1）水相 pH：對于帶正電荷的表面活性劑，水相 pH高于蛋白質的等電點（帶負電）時，有利于蛋白質溶于反膠束中，對于陰離子表面活性劑則相反 （ 2）離子強度 ：水相中的離子強度決定帶電表面所賦予的靜電屏蔽程度：降低表面活性劑頭部基團間的靜電斥力，導致反膠束顆粒變??；降低了帶電蛋白質分子和反膠束帶電界面間的靜電相互作用 酶的組合分離純化策略 Resolution（分辨率） Speed Capacity（容量） Recovery（回收率） 設計分離純化工藝的基本要求 酶的濃縮、干燥與結晶 濃縮與干燥都是酶與溶劑（通常是水）分離的過程。在酶的分離純化過程中是一個重要的環(huán)節(jié)。 離心分離、過濾與膜分離、沉淀分離、層析分離等都能起到濃縮作用。用各種吸水劑，如硅膠、聚乙二醇、干燥凝膠等吸去水分，也可以達到濃縮效果。 蒸發(fā)濃縮是通過加熱或者減壓方法使溶液中的部分溶劑汽化蒸發(fā)，使溶液得以濃縮的過程。由于酶在高溫條件下不穩(wěn)定，容易變性失活，故酶液的濃縮通常采用 真空濃縮 －即在一定的真空條件下，使酶液在60℃ 以下進行濃縮 。 在固體酶制劑的生產過程中，為了提高酶的穩(wěn)定性，便于保存、運輸和使用，一般都必須進行干燥。常用的干燥方法有： 真空干燥 ： 邊抽真空邊加熱， 溫度控制在 60攝氏度以下酶液蒸發(fā)干燥 冷凍干燥： 固態(tài)冰在低溫真空下直接升華為氣體 噴霧干燥： 酶液噴成小霧滴，分散于熱氣流中，水分在幾秒鐘內蒸發(fā)，霧滴周圍空氣溫度較低，得到干燥酶制劑。要控制好氣流進口溫度 氣流干燥： 熱氣流直接與固體或半固態(tài)的物料接觸使物料水分蒸發(fā)得以干燥。干燥時間長，酶活力損失大，要控制氣流溫度、速度和流向，同時要經常翻動物料，使之干燥均勻 吸附干燥： 密閉容器中用各種干燥劑吸收物料中的水分達到干燥目的，如硅膠、無水氯化鈣、無水硫酸鈣等等 ? 結晶是溶質以晶體形式從溶液中析出的過程。酶的結晶是酶分離純化的一種手段。它不僅為酶的結構與功能等的研究提供了適宜的樣品，而且為較高純度的酶的獲得和應用創(chuàng)造了條件 ? 酶在結晶之前， 酶液必須經過純化達到一定的純度 。如果酶液純度太低，不能進行結晶。通常酶的純度應當在 50%以上，方能進行結晶?？偟内厔菔敲傅募兌仍礁撸饺菀走M行結晶。 要說明的是，不同的酶對結晶時的純度要求不同。 有些酶在純度達到 50%時就可能結晶，而有些酶在純度很高的條件下也無法析出結晶。所以酶的結晶并非達到絕對純化，只是達到相當的純度而已 。 鹽析結晶 有機溶劑結晶 透析平衡結晶 等電點結晶 溫度差結晶