【正文】 術(shù)的特點(diǎn)是 選擇性很高 ， 可減少提純步驟 ? 在親和層析中 ,作為固定相的一方稱為 配基(Ligand)， 配基必須偶聯(lián)于不溶性母體 (Matrix)上，母體又稱為載體或擔(dān)體。 凝膠層析操作過程 （詳見蛋白質(zhì)工程 p213） 洗脫完畢后，凝膠柱已經(jīng)恢復(fù)酶液上樣前的狀態(tài)， 不需再生 處理就可以重復(fù)進(jìn)行下一批分離純化。裝好后洗脫液浸沒凝膠表面。每一類型化合物都有其各自特定的選擇曲線。是指以各種多孔凝膠為固定相，利用流動相中所含各種組分的相對分子質(zhì)量不同而達(dá)到物質(zhì)分離的一種層析技術(shù) 凝膠層析的基本原理 凝膠層析柱中裝有 多孔凝膠 ，當(dāng)含有各種組分的混合溶液流經(jīng)凝膠層析柱時，大分子物質(zhì)由于分子直徑大，不能進(jìn)入凝膠的微孔，只能分布于凝膠顆粒的間隙中，以較快的速度流過凝膠柱。 對多組分為達(dá)到良好的分離效果， 常用濃度梯度或 pH梯度洗脫法 ，每一種又可選用階段梯度洗脫或連續(xù)梯度洗脫，后者分辨率更高。 離子交換層析介質(zhì)由三部分組成： 惰性支持物；帶電基團(tuán)；（帶電基團(tuán)的）平衡離子 通常所說的離子交換實(shí)際上是 蛋白質(zhì)分子與平衡離子間相互交換 ，他們共同競爭離子交換層析介質(zhì)中的帶電基團(tuán) 陽離子交換層析－ 平衡離子為陽離子，層析介質(zhì)的帶電基團(tuán)帶有負(fù)電 陰離子交換層析－ 平衡離子為陰離子，層析介質(zhì)的帶電基團(tuán)帶有正電 離子交換劑的選擇 應(yīng)根據(jù)欲分離組分的特性和要求，過強(qiáng)的吸附以及極端的洗脫條件都可能造成活性分子的變性失活；另外溶液的 pH直接決定離子交換劑活性基團(tuán)及組分離子的解離程度，從而影響了離子交換劑的交換容量和交換的選擇性 選擇離子交換劑時考慮因素： 1）離子交換劑和組分離子的物理化學(xué)性質(zhì)； 2）組分離子所帶電荷種類； 3）溶液中組分離子的濃度高低； 4）組分離子的質(zhì)量大?。? 5）組分離子與離子交換劑的親和力大小 離子交換劑的處理 1）溶脹、洗滌至澄清； 2) 4V 2 mol/L HCl進(jìn)行酸處理，洗滌； 3) 4V 2 mol/L NaOH進(jìn)行堿處理，洗滌； 4）裝柱 5）用適當(dāng)?shù)脑噭┻M(jìn)行轉(zhuǎn)型處理，使離子交換劑上所帶的可交換離子轉(zhuǎn)變?yōu)樗桦x子 例如，陽離子交換劑（如）用 NaOH處理，轉(zhuǎn)變?yōu)?Na+型，用 HCl處理，轉(zhuǎn)變?yōu)?H+型； 陰離子交換劑用 NaOH處理，轉(zhuǎn)變?yōu)?OH型，用 HCl處理轉(zhuǎn)變?yōu)?Cl型 離子交換劑有離子交換樹脂、纖維素、凝膠，某些大孔徑的離子交換樹脂、纖維素、凝膠可用于酶的分離純化。另一種與固定相溶劑互不相溶的溶劑可沿著固定相流動，稱為 流動相 。 ? 溶劑洗脫法 －采用單一或混合的溶劑進(jìn)行洗脫，各組分按照由弱到強(qiáng)的順序先后流出，以洗脫液對組分濃度作圖呈峰狀，兩組分之間有一空白。 它是利用混合物中各組分的物理化學(xué)性質(zhì)的差別，使各組分以不同程度分布在兩個相中，其中一個相為固定的 (稱為固定相 )，另一個相則流過此固定相 (稱為流動相 )并使各組分以不同速度移動，從而達(dá)到分離 。 膜分離過程中，薄膜的作用是選擇性地讓小于其孔徑的物質(zhì)顆?；蚍肿油ㄟ^，而把大于其孔徑的顆粒截留 。～ m 病毒、生物大分子等 超濾膜 反滲透 20197。 不同沉降 系數(shù) 的 蛋白質(zhì) ，可利用超高速 離心 法，在密度梯度中作分 離 。（密度相近，分子量不同）梯度較淺，密度較低 等密度梯度離心： 分離密度不同的顆粒，欲分離顆粒處于密度梯度中的等密度點(diǎn)（平衡）才可停止離心，操作時先把一定濃度的介質(zhì)溶液與樣品液混合均勻 。有些高速離心機(jī)裝設(shè)有冷凍裝置 ,謂之高速冷凍離心機(jī) 超速離心機(jī) 的最大轉(zhuǎn)速達(dá) (～ 12) 104 r/min，相對離心力可以高達(dá) 5 105 g甚至更高。 在離心分離時，要根據(jù)欲分離物質(zhì)以及雜質(zhì)的 顆粒大小 、 密度和特性的不同 ，選擇適當(dāng)?shù)碾x心機(jī)、離心方法和離心條件。主要是由于有機(jī)溶劑的存在會使溶液的介電常數(shù)降低。其中以硫酸銨最為常用。 為了使蛋白質(zhì)充分溶解并保持蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與活性，蛋白質(zhì)提取緩沖液常包含的成分 ? 控制溶液 pH值的緩沖對； ? 控制溶液離子強(qiáng)度的無機(jī)鹽； ? 控制溶液氧化還原狀態(tài)的還原劑； ? 蛋白酶抑制劑 ? 離子螯合劑 ? 標(biāo)準(zhǔn)牛血清白蛋白 ? 去污劑 ? 水和防腐劑 ? 甘油 酶的主要提取方法 提取方法 使用的溶劑或溶液 提取對象 鹽溶液提取 ～ 的鹽溶液 用于提取在低濃度鹽溶液中溶解度較大的酶 酸溶液提取 PH2～ 6的水溶液 用于提取在稀酸溶液中溶解度大，且穩(wěn)定性較好的酶 堿溶液提取 PH8～ 12的水溶液 用于提取在稀堿溶液中溶解度大且穩(wěn)定性較好的酶 有機(jī)溶劑提取 可與水混溶的有機(jī)溶劑 用于提取那些與脂質(zhì)結(jié)合牢固或含有較多非極性基團(tuán)的酶 大多數(shù)蛋白類酶都溶于水，而且在低濃度的鹽存在的條件下，酶的溶解度隨鹽濃度的升高而增加，這稱為 鹽溶現(xiàn)象 。一般說來，極性物質(zhì)易溶于極性溶劑中，非極性物質(zhì)易溶于非極性的有機(jī)溶劑中，酸性物質(zhì)易溶于堿性溶劑中，堿性物質(zhì)易溶于酸性溶劑中。 通過各種物理因素的作用，使組織、細(xì)胞的外層結(jié)構(gòu)破壞，而使細(xì)胞破碎 。 (3) 均 質(zhì)酶 (homogeneous): 目標(biāo)酶的 進(jìn) 一步精制純化，可用制備 式 電泳 或 HPLC。 (2) 部分純化 (partially purified): 初步的純化，使用各鐘 柱 層 析法 。 1）機(jī)械破碎 2）物理破碎 3）化學(xué)破碎 4）酶解破碎 JY92II D超聲波 細(xì)胞粉碎機(jī) 細(xì)胞破碎珠 高壓細(xì)胞破碎機(jī) DY89I型 電動玻璃勻漿機(jī) 機(jī)械破碎 搗碎法 研磨法 勻漿法 物理破碎 溫度差破碎法 壓力差破碎法 超聲波破碎法 化學(xué)破碎 有機(jī)溶劑： 甲苯、丙酮 丁醇、氯仿 表面活性劑： Triton、 Tween 酶促破碎 自溶法 外加酶制劑法 通過機(jī)械運(yùn)動產(chǎn)生的剪切力，使組織、細(xì)胞破碎 。 ? 酶提取時首先應(yīng)根據(jù)酶的結(jié)構(gòu)和溶解性質(zhì)，選擇適當(dāng)?shù)娜軇?。 為了提高酶的提取率并防止酶的變性失活，在提取過程中還要注意控制好 溫度 、 pH值等提取條件 。鹽析的主要原理在于高濃度鹽離子與蛋白質(zhì)爭奪水化水，破壞蛋白質(zhì)分子表面的水化膜，同時由于反離子作用，也影響蛋白質(zhì)分子所帶電荷 在一定的溫度和 pH值條件下（ β 為常數(shù)），通過改變離子強(qiáng)度使不同的酶或蛋白質(zhì)分離的方法稱為 Ks分段鹽析 ； 而在一定的鹽和離子強(qiáng)度的條件下（ KsI為常數(shù)），通過改變溫度