蛋白類酶的分離純化-wenkub
2023-06-10 18:23:46 本頁面
【正文】 弱的組分開始最先流出。 層析方法 分離依據(jù) 吸附層析 利用吸附劑對(duì)不同物質(zhì)的吸附力不同而使混合物中各組分分離（分子表面特性） 分配層析 利用各組分在兩相中的分配系數(shù)不同，而使各組分分離（溶解度） 離子交換層析 利用離子交換劑上的可解離基團(tuán)（活性基團(tuán)）對(duì)各種離子的親和力不同而達(dá)到分離目的（帶電性質(zhì)） 凝膠層析 以各種多孔凝膠為固定相，利用流動(dòng)相中所含各種組分的相對(duì)分子質(zhì)量不同而達(dá)到物質(zhì)分離（分子大小） 親和層析 利用生物分子與配基之間所具有的專一而又可逆的親和力，使生物分子分離純化（分子形狀） 層析聚焦 將酶等兩性物質(zhì)的等電點(diǎn)特性與離子交換層析的特性結(jié)合在一起，實(shí)現(xiàn)組分分離 吸附層析 吸附層析是利用吸附劑對(duì)不同物質(zhì)的吸附力不同而使混合物中各組分分離的方法 ? 吸附層析通常采用柱型裝置，將吸附劑裝在吸附柱中，裝置成 吸附層析柱 。膜的孔徑有多種規(guī)格可供使用時(shí)選擇 。 生物小分子、鹽、離子 反滲透膜 借助于一定孔徑的高分子薄膜，將不同大小、不同形狀和不同特性的物質(zhì)顆?；蚍肿舆M(jìn)行分離的技術(shù)稱為膜分離技術(shù)。 過濾與膜分離 過濾是借助于 過濾介質(zhì) 將不同大小、不同形狀的物質(zhì)分離的技術(shù)過程 。（密度不同，分子量相近）梯度陡峭，密度較高 ? 密度梯度離心前用密度梯度混合器預(yù)先配制密度梯度系統(tǒng)，貯液室與混合室的截面積關(guān)系決定梯度類型。超速離心主要用于 DNA、 RNA、蛋白質(zhì)等生物大分子以及細(xì)胞器、病毒等的分離純化；樣品純度的檢測(cè)；沉降系數(shù)和相對(duì)分子質(zhì)量的測(cè)定等。 常速離心機(jī)又稱為低速離心機(jī) , 其最大轉(zhuǎn)速在 8000 r/min以內(nèi)，相對(duì)離心力（ RCF）在 1 104 g 以下，在酶的分離純化過程中，主要用于細(xì)胞、細(xì)胞碎片和培養(yǎng)基殘?jiān)裙绦挝锏姆蛛x。例如，20℃ 時(shí)水的介電常數(shù)為 80，而 82％乙醇水溶液的介電常數(shù)為 40。這是由于硫酸銨在水中的溶解度大而且溫度系數(shù)小，不影響酶的活性，分離效果好，而且價(jià)廉易得。 酶的分離方法 沉淀分離 離心分離 過濾與膜分離 層析分離 電泳分離 萃取分離 沉淀分離 沉淀分離是通過改變某些條件或添加某種物質(zhì)，使酶的 溶解度降低 ，而從溶液中沉淀析出，與其它溶質(zhì)分離的技術(shù)過程。 ? 酶都能溶解于水， 通?？捎盟蛳∷?、稀堿、稀鹽溶液等進(jìn)行提取 ，有些酶與脂質(zhì)結(jié)合或含有較多的非極性基團(tuán)，則可用有機(jī)溶劑提取。 通過各種化學(xué)試劑對(duì)細(xì)胞膜的作用，而使細(xì)胞破碎 通過細(xì)胞本身的酶系或外加酶制劑的催化作用 ，使細(xì)胞外層結(jié)構(gòu)受到破壞，而達(dá)到細(xì)胞破碎 細(xì)胞破碎方法及其原理 ? 酶的提取是指在一定的條件下，用適當(dāng)?shù)娜軇┗蛉芤禾幚砗冈?，使酶充分溶解到溶劑或溶液中的過程。 酶分離純化不同階段 細(xì)胞破碎 許多酶存在于細(xì)胞內(nèi)。第四章 酶的分離純化 酶分離純化的原因（ 3條） 酶分離純化鑒定的依據(jù)－蛋白質(zhì)的物理化學(xué)特性（ 9條） 內(nèi) 容 酶的提取與分離純化技術(shù)路線 細(xì)胞破碎 酶的提取 酶的分離方法 酶的組合分離純化策略 酶的濃縮、干燥與結(jié)晶 細(xì)胞結(jié)構(gòu)與酶分布 酶的提取、分離純化技術(shù)路線 細(xì)胞破碎 酶提取 酶分離純化 酶濃縮 酶貯存 動(dòng)物、植物或微生物細(xì)胞 發(fā)酵液 離心，過濾、沉淀、層析分離、電泳、萃取、結(jié)晶等分離方法 酶 的純化過程，約可分為三 個(gè)階段 ： (1) 粗 蛋白質(zhì) (crude protein): 采樣 → 均 質(zhì)打破細(xì)胞 → 抽出全蛋白，多使用 鹽 析 沉淀 法 ；可以粗略去除蛋白質(zhì)以外的物質(zhì)。為了提取這些胞內(nèi)酶，首先需要對(duì)細(xì)胞進(jìn)行破碎處理。也稱為酶的抽提。 酶的提取 提高溫度，降低溶液粘度、增加擴(kuò)散面積、縮短擴(kuò)散距離，增大濃度差等都有利于提高酶分子的擴(kuò)散速度，從而增大提取效果。 沉淀分離方法 分離原理 鹽析沉淀法 利用不同蛋白質(zhì)在不同的鹽濃度條件下溶解度不同的特性，通過在酶液中添加一定濃度的中性鹽，使酶或雜質(zhì)從溶液中析出沉淀，從而使酶與雜質(zhì)分離 等電點(diǎn)沉淀法 利用兩性電解質(zhì)在等電點(diǎn)時(shí)溶解度最低，以及不同的兩性電解質(zhì)有不同的等電點(diǎn)這一特性，通過調(diào)節(jié)溶液的 pH值，使酶或雜質(zhì)沉淀析出，從而使酶與雜質(zhì)分離 有機(jī)溶劑沉淀法 利用酶與其它雜質(zhì)在有機(jī)溶劑中的溶解度不同，通過添加一定量的某種有機(jī)溶劑，使酶或雜質(zhì)沉淀析出，從而使酶與雜質(zhì)分離 復(fù)合沉淀法 在酶液中加入某些物質(zhì)，使它與酶形成復(fù)合物而沉淀下來，從而使酶與雜質(zhì)分離 選擇性變性沉淀法 選擇一定的條件使酶液中存在的某些雜質(zhì)變性沉淀，而不影響所需的酶，從而使酶與雜質(zhì)分離 在鹽濃度達(dá)到某一界限后，酶的溶解度隨鹽濃度升高而降低，這稱為 鹽析 現(xiàn)象。然而用硫酸銨進(jìn)行鹽析時(shí)，緩沖能力較差，而且銨離子的存在會(huì)干擾蛋白質(zhì)的測(cè)定，所以有時(shí)也用其它中性鹽進(jìn)行鹽析。 溶液的介電常數(shù)降低，就使溶質(zhì)分子間的靜電引力增大，互相吸引而易于凝集，同時(shí)，對(duì)于具有水膜的分子來說，有機(jī)溶劑與水互相作用，使溶質(zhì)分子表面的水膜破壞，也使其溶解度降低而沉淀析出 。也用于酶的結(jié)晶等較大顆粒的分離。 超速離心有三種： 差速離心 ：采用不同的離心速度和離心時(shí)間，使不同沉降速度的顆粒分批分離的方法 密度梯度離心： 使沉降系數(shù)比較接近的物質(zhì)得以分離的一種區(qū)帶分離方法。 ? 配制中， 將稀溶液置于貯液室 B，濃溶液置于混合室 A, 如圖 42(郭勇酶工程 p96） 流出的梯度液經(jīng)過導(dǎo)管小心收集于離心管 ， 如果濃溶液置于貯液室 B ，稀溶液置于 A室，梯度液的導(dǎo)液管必須直插到離心管的管底 ，讓后來流入的濃度高的混合液將先流入的濃度較低的混合液頂浮起來形成由管口到管底逐步升高的密度梯度 超速離心機(jī)按照其用途可以分為制備用超速離心機(jī)、分析用超速離心機(jī)和分析 制備兩用超速離心機(jī) 3種 ? 蛋白質(zhì) 分子在 離心 時(shí)，其 分子量、分子密度 、組成、 形 狀 等，均 會(huì)影響 其沉降速率， 沉降 系數(shù) 即用 來描述 此沉降 性質(zhì) ； 其 單位為 S (Svedberg unit)。 過濾介質(zhì)多種多樣，常用的有濾紙、濾布、纖維、多孔陶瓷、燒結(jié)金屬和各種高分子膜等，可以根據(jù)需要選用。膜分離所使用的薄膜主要是由 丙烯腈 、 醋酸纖維素 、 賽璐玢 以及 尼龍 等高分子聚合物制成的高分子膜。 膜分離 加壓膜分離 微濾 超濾 反滲透 電場(chǎng)膜分離 電滲析 離子交換膜電滲析 擴(kuò)散膜分離 透析 根據(jù)膜材料和不同進(jìn)料液的特性，商品應(yīng)用的膜產(chǎn)品通常采取如下幾種結(jié)構(gòu)形式：管式；中空纖維；卷式；平板式。 ? 層析時(shí)，欲分離的混合溶液自柱頂加入，當(dāng)樣品液全部進(jìn)入吸附層析柱后，再加入洗脫劑解吸洗
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