【正文】 landscape），如圖3所示，漏斗下方的凹凸反映蛋白質(zhì)構(gòu)象瞬間進(jìn)入局部自由能最小區(qū)域(13,14)。在蛋白質(zhì)的折疊過程中，有許多作用力參與，包括一些構(gòu)象的空間阻礙，范德華力，氫鍵的相互作用，疏水效應(yīng)，離子相互作用，多肽和周圍溶劑相互作用產(chǎn)生的熵驅(qū)動的折疊（12,52），但對于蛋白質(zhì)獲得天然結(jié)構(gòu)這一復(fù)雜過程的特異性，我們還知之甚少，許多實驗和理論的工作都在加深我們對折疊的認(rèn)識，但是問題仍然沒有解決。對蛋白質(zhì)折疊機(jī)理的研究，對保留蛋白質(zhì)活性，維持蛋白質(zhì)穩(wěn)定性和包涵體蛋白質(zhì)折疊復(fù)性都具有重要的意義(21)。通常從包涵體中回收活性蛋白質(zhì)包括三個步驟：包涵體的分離和洗滌，包涵體蛋白質(zhì)的溶解和溶解蛋白質(zhì)的再折疊。在高的變性劑濃度，蛋白質(zhì)是去折疊的，充分溶劑化的，柔性的，在折疊緩沖溶液中，蛋白質(zhì)是折疊的，具有剛性的，將蛋白質(zhì)從高變性劑濃度條件變?yōu)檎郫B緩沖溶液，就會使蛋白質(zhì)坍塌形成緊湊的結(jié)構(gòu)，但蛋白的這一過程不總能有效進(jìn)行，常常存在錯誤折疊和聚集，所以在包涵體的變復(fù)性過程中，除了要控制上面所講的參數(shù)，還有兩方面的參數(shù)需要控制，一是應(yīng)用添加劑，來促進(jìn)折疊、減少聚集，二是控制溶液的氧化還原狀態(tài)促進(jìn)二硫鍵的正確配對。在低的變性劑濃度條件下，如圖2中a區(qū)段所示，天然構(gòu)象的蛋白質(zhì)是穩(wěn)定的，但也會穩(wěn)定部分折疊的中間體，這些部分折疊的易于自我締合形成沉淀。圖2：在各種變性劑濃度條件下蛋白質(zhì)的溶解性和構(gòu)象。所以如果對于包涵體蛋白質(zhì)，通過機(jī)制的研究，能夠解決折疊復(fù)性的問題，那么利用包涵體的高水平表達(dá)，就可以得到大量的蛋白質(zhì)，降低生產(chǎn)的成本。所以如果包涵體蛋白可以進(jìn)行體外的正確折疊，那么形成包涵體就可以接受，對易受細(xì)菌蛋白酶降解的蛋白質(zhì)或?qū)?xì)菌有毒性的蛋白質(zhì)來說，表達(dá)產(chǎn)生包涵體是絕對必要的?，F(xiàn)在發(fā)展了許多方法減少包涵體的形成，如使用中等強度或弱的啟動子，低溫培養(yǎng)，有限的誘導(dǎo)，優(yōu)化培養(yǎng)基條件，進(jìn)行融合表達(dá)(49)，與伴侶分子和折疊酶共表達(dá)(3,5)，表達(dá)定位于不同的空間(7,58)，選擇突變的菌株（6,43）或其他的原核表達(dá)系統(tǒng)(34)。膜蛋白具有暴露的疏水區(qū)，表達(dá)時易于聚集形成包涵體，也有可能由于降解或?qū)?xì)胞的毒性作用使得表達(dá)水平極低（45）。包涵體的形成是一個由許多蛋白質(zhì)參與的極端復(fù)雜的動力學(xué)過程，依賴于蛋白質(zhì)的折疊速率和聚集速率，并且與蛋白質(zhì)的合成和降解程度相關(guān)（35）。雙水相萃取和擴(kuò)張床吸附技術(shù)，可以處理全液，通過整合技術(shù)的使用，能達(dá)到萃取、濃縮和初步純化的目的。在初始的純化階段，除了使目標(biāo)蛋白和細(xì)胞內(nèi)的DNA、RNA、多糖以及性質(zhì)差別較大的蛋白質(zhì)成分分離，采用的分離方法要能除去影響目標(biāo)蛋白穩(wěn)定性的雜質(zhì)，保護(hù)目標(biāo)蛋白不被蛋白酶降解，進(jìn)行目標(biāo)蛋白的捕獲和濃縮。在分離純化中對每個步驟的選擇，可以遵循以下原則：1 應(yīng)盡可能的利用蛋白質(zhì)的不同物理特性選擇所用的分離純化技術(shù)，而不是利用相同的技術(shù)進(jìn)行多次純化；2不同的蛋白質(zhì)在性質(zhì)上有很大的不同，這是能從復(fù)雜的混合物中純化出目標(biāo)蛋白的依據(jù)，每一步純化步驟應(yīng)當(dāng)充分利用目標(biāo)蛋白和雜質(zhì)成分物理性質(zhì)的差異。分離純化的方法策略及其應(yīng)用在純化的過程中，需要監(jiān)測以下幾個參數(shù)：總的樣品體積，樣品中總的蛋白，目標(biāo)蛋白的活性單位，通過這些基本的信息，就可以跟蹤每步純化的效率，計算出目標(biāo)蛋白的回收率，目標(biāo)蛋白的比活性，以及純化的倍數(shù)，從而對純化的每一步，乃至整個流程進(jìn)行定量評價。靈敏的分析方法僅需要少量的樣品，這就給操作帶來了極大的方便。這些特異性的分析方法都是基于目標(biāo)蛋白的一些特性，如酶的活性，免疫學(xué)活性，物理特性（如分子量、等電點、光譜學(xué)特征等），生物學(xué)活性。根據(jù)報導(dǎo)蛋白質(zhì)的ΔGf→u在5—20kcal/mol范圍之間，—2kcal/mol自由能的變化，—，因此ΔGf→u相對比較小，這樣天然狀態(tài)僅僅比去折疊狀態(tài)穩(wěn)定一點，所以必須克服蛋白質(zhì)內(nèi)在的不穩(wěn)定性，保留蛋白的活性。在細(xì)胞的提取物中，除了目標(biāo)蛋白外，還含有其它各種性質(zhì)的蛋白、核酸、多糖等。不需要體外溶解和折疊，一般具有正確的結(jié)構(gòu)和功能胞內(nèi)包涵體表達(dá)表達(dá)水平低，多數(shù)蛋白不能進(jìn)行分泌表達(dá)，表達(dá)蛋白需要進(jìn)行濃縮分泌表達(dá)至細(xì)胞外目前應(yīng)用最廣泛的表達(dá)系統(tǒng)有三大類，分別是大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)、表達(dá)系統(tǒng)和CHO細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)，不同的表達(dá)系統(tǒng)和培養(yǎng)方法顯著影響下游的處理過程，目標(biāo)蛋白表達(dá)是否形成包涵體，目標(biāo)蛋白表達(dá)的定位（胞內(nèi)、細(xì)胞內(nèi)膜、周質(zhì)空間和胞外），蛋白表達(dá)的量都依賴于所選擇的表達(dá)系統(tǒng)。重組蛋白和多肽的分離純化1.選擇將所表達(dá)的蛋白分泌到細(xì)胞外或周質(zhì)空間可以避免破碎細(xì)胞的步驟，并且由于蛋白質(zhì)種類少，目標(biāo)蛋白容易純化；而在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)表達(dá)蛋白，可能是可溶性表達(dá)，可能形成包涵體，可溶性的蛋白往往需要復(fù)雜的純化步驟，而包涵體易于分離，純度較高，但回收具有生物活性的蛋白卻變的相當(dāng)困難，需要對聚集的蛋白進(jìn)行變復(fù)性，通常活性蛋白的得率比較低，表1列出了不同策略對表達(dá)、純化的影響，對于其中的有些缺點可以通過一定的方法進(jìn)行克服和避免，如利用DNA重組技術(shù)給外源蛋白加上一個親和純化的標(biāo)簽，有助于可溶性外源蛋白的選擇性純化，并能保護(hù)目標(biāo)蛋白不被降解（96）。增強正確二硫鍵的形成，降低蛋白酶對表達(dá)蛋白的降解，可獲得確定的N末端，顯著減少雜蛋白水平，簡化純化，不需要細(xì)胞破碎好些蛋白不能分泌進(jìn)入周質(zhì)空間，沒有大規(guī)模選擇性的釋放周質(zhì)空間蛋白的技術(shù)，周質(zhì)蛋白酶可引起重組蛋白酶解胞內(nèi)可溶性蛋白表達(dá)在這樣一個混合體系中，蛋白質(zhì)純化要求將目標(biāo)蛋白與其它的成分分離，得到一定的量，達(dá)到一定的純度，同時要盡可能保留蛋白的生物活性，并使蛋白保持完整。蛋白質(zhì)的功能依賴于蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，對于有生物活性的蛋白質(zhì)，在分離純化過程中必須根據(jù)目標(biāo)蛋白的特點，采用合適的操作條件和方法，保證目標(biāo)蛋白的活性盡量不損失。這一點在分離純化和蛋白質(zhì)儲存中都很重要，影響蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的因素有溫度、pH、離子強度、某些添加劑、表面吸附、震搖、剪切力、凍融、蛋白濃度、壓力等，這些因素對折疊的影響有的是可逆的，有的是不可逆的，而且相互之間也有影響，在實際處理中應(yīng)選擇合適的條件，盡量避免不利因素的影響（2），并利用活性跟蹤的方法對處理進(jìn)行評價，指導(dǎo)分離純化。在理想的情況下，我們希望所選擇的分析方法具有特異、快速、靈敏和可定量的特點。在分離純化的每一步，都需要對蛋白和活性進(jìn)行定量，這就要求分析方法有準(zhǔn)確可定量的特點，以對分離純化的效果進(jìn)行評價。Richard等在純化重組大腸桿菌RNA聚合酶σ32亞基的工作中給出了很好的范例，在定量測定項中，包括了蛋白質(zhì)的定量測定、定量SDSPAGE、定量蛋白質(zhì)斑點印跡和酶活測定，使用這些方法對操作的每一個階段取樣進(jìn)行純化效果的評價，從而確保每一步純化的有效性（1）。下游的分離純化步驟不僅要在可替換的分離技術(shù)間進(jìn)行選擇，如細(xì)胞的破碎可選擇高壓勻漿法、高速珠磨法、超聲破碎或酶溶法，分離細(xì)胞、細(xì)胞碎片、包涵體和沉淀物，可選擇離心或過濾，需要進(jìn)行濃縮的時候，可選擇沉淀或超濾；另一方面，設(shè)計的純化工藝包括特定的層析步驟，及層析的先后順序，以期得到最大的得率。所以在分離純化的開始階段，要盡可能的了解目標(biāo)蛋白的特性，不僅如此還要了解所存在雜質(zhì)成分的性質(zhì)，如大腸桿菌的蛋白大多是一些低分子量的蛋白（50000Da），而且酸性蛋白較多；3 在純化的早期階段要盡量減少處理的體積，方便后續(xù)的純化；4 在純化的后期階段，再使用造價高的純化方法，這是因為處理的量和雜質(zhì)的量都已減少，有利于昂貴純化材料的重復(fù)使用，減少再生的復(fù)雜性（84）。在這一階段的純化中，鹽析沉淀仍然應(yīng)用，但共沉淀的雜質(zhì)常常很多，離子交換層析和疏水層析具有操作上的優(yōu)點，可以再生使用，成為這一步通常選用的層析方法；中間階段純化是最為關(guān)鍵的階段，這時要能達(dá)到和大量的雜蛋白分離，利用蛋白質(zhì)不同的性質(zhì)選擇不同的純化方法，每一步的方法要有足夠的選擇性，提高目標(biāo)蛋白質(zhì)的純度；最后進(jìn)行精制純化，常用凝膠層析，使目標(biāo)蛋白的純度進(jìn)一步提高達(dá)到要求。另外這兩種技術(shù)和親和相互作用結(jié)合可進(jìn)一步提高處理的選擇性。 包涵體蛋白質(zhì)的折疊復(fù)性強的表達(dá)系統(tǒng)，高的誘導(dǎo)劑濃度，相對較高的培養(yǎng)溫度常常造成包涵體的形成。蛋白質(zhì)的糖基化可以影響到蛋白質(zhì)的折疊行為和溶解性，當(dāng)它們在原核系統(tǒng)進(jìn)行表達(dá)時，也容易聚集（4）。由于影響蛋白質(zhì)細(xì)胞合成和折疊的因素太多，優(yōu)化結(jié)果不可預(yù)測，如對于Fab片段，盡管只有可變區(qū)序列不同，也不能預(yù)測新的Fab片段在體內(nèi)是否可以正確折疊（4），所以即使采用了促進(jìn)可溶性表達(dá)的方法，也不能保證不形成包涵體。內(nèi)皮抑素（endostatin）可以特異性的抑制內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，具有抑制新生血管生成和抑制腫瘤生長的作用，已進(jìn)入臨床研究階段。所以選擇b區(qū)段所在的變性劑濃度來進(jìn)行蛋白質(zhì)的折疊更為有效，這一區(qū)段即可以穩(wěn)定蛋白質(zhì)的天然構(gòu)象，而且可以增加天然構(gòu)象蛋白質(zhì)的溶解性，對于部分折疊的卻沒有穩(wěn)定作用。前兩個步驟效率較高，但是再折疊的效率率常常不能令人滿意，折疊的方法和折疊的條件需要通過實驗來進(jìn)行篩選。早在上世紀(jì)30年代，我國生化界先驅(qū)吳憲教授就對蛋白質(zhì)的變性作用進(jìn)行了闡釋（8），30年后，Anfinsen通過對核糖核酸酶A的經(jīng)典研究表明去折疊的蛋白質(zhì)在體外可以自發(fā)的進(jìn)行再折疊，僅僅是序列本身已經(jīng)包括了蛋白質(zhì)正確折疊的所有信息（9,10），并提出蛋白質(zhì)折疊的熱力學(xué)假說，為此Anfinsen獲得1972年諾貝爾化學(xué)獎。通常要選用強的變性劑使蛋白質(zhì)完全變性溶解，如6 M的鹽酸胍和8 M 的尿素，蛋白質(zhì)濃度多采用110mg/ml（22）。以上變性的方法屬于化學(xué)變性，使用高的靜力壓提供了蛋白質(zhì)變性的另外一種物理變性方法，靜力壓促進(jìn)蛋白質(zhì)變性解離，是因為蛋白質(zhì)在變性條件下，系統(tǒng)整體趨向于更小的體積。蛋白質(zhì)分子變性后，通過改變折疊的條件使蛋白質(zhì)恢復(fù)其天然構(gòu)象的過程，稱為復(fù)性。增加蛋白質(zhì)折疊的添加劑阿拉伯聚糖，增加黏度兩性離子表面活性劑（Zwitterionic detergents），保護(hù)非極性表面N氧化三甲胺（TMAO），對蛋白質(zhì)具有優(yōu)先的水合作用/滲壓劑配體，穩(wěn)定天然結(jié)構(gòu)狀態(tài)人組織纖溶酶原激活劑（tPA）含有35個半胱氨酸殘基，可形成17對二硫鍵，即使在天然狀態(tài)下也只具有低的溶解性，進(jìn)行原核表達(dá)時這兩種巰基保護(hù)方法都被用于該蛋白質(zhì)的折疊復(fù)性，由于在蛋白質(zhì)的巰基上引入了帶電荷的殘基，增加了變性蛋白和部分折疊的溶解性，減少了復(fù)性過程中蛋白質(zhì)的聚集，可獲得較高的復(fù)性效率（25,32,33）。 稀釋復(fù)性和透析復(fù)性對于折疊，是一個一級的反應(yīng)過程，而聚集是一個高級的反應(yīng)過程，依賴蛋白質(zhì)的濃度，所以需要小心的選擇蛋白質(zhì)的濃度，一般的蛋白質(zhì)的終濃度保持在2050μg/mL。除了要考慮降低變性劑的濃度，還要考慮每一階段的氧化還原狀態(tài)，以及溫度、添加劑等因素。這個研究小組用相同的方法進(jìn)行白介素12包涵體的折疊復(fù)性，僅加入氧化型谷胱甘肽而沒有還原型谷胱甘肽只有約57%的折疊效率，當(dāng)兩者同時加入后則可達(dá)到90%（42），這些結(jié)果表明前一種蛋白比較容易形成正確的二硫鍵，而白介素12折疊復(fù)性需要加入還原型的谷胱甘肽促進(jìn)二硫鍵重組，使蛋白質(zhì)最終選擇天然的二硫鍵，并促進(jìn)折疊。色譜復(fù)性的方法的優(yōu)點是可以顯著的減少處理的時間，減少變復(fù)性過程中分子的聚集，使復(fù)性的同時也達(dá)到了純化的效果。在折疊中，吸附的位點會影響到折疊，所以要優(yōu)化折疊的條件，才能得到好的折疊效果。凝膠過濾復(fù)性時，變性蛋白質(zhì)加樣于折疊緩沖液平衡好的凝膠過濾柱上，然后用折疊緩沖液進(jìn)行洗脫，凝膠過濾層析有不同的分子量分級范圍，有助于聚集蛋白質(zhì)和正確折疊蛋白質(zhì)的分離。在凝膠過濾復(fù)性中，發(fā)展了一種梯度復(fù)性的方法，這一方法的原理基于復(fù)性過程中，變性條件的快速改變加速了部分折疊蛋白質(zhì)的聚集，導(dǎo)致沉淀形成和非特異性的吸附，通過梯度洗脫逐步降低變性劑的濃度，使蛋白質(zhì)處于一個梯度改變的變性劑條件下，控制蛋白質(zhì)的折疊和聚集速度，使蛋白質(zhì)在離開層析柱時，處于折疊緩沖液中，從而改善活性蛋白的回收率。對單鏈Fv片段包涵體蛋白，使用梯度同時改變變性劑濃度和pH，比單改變變性劑濃度的梯度復(fù)性或不使用梯度的凝膠過濾復(fù)性具有更高的活性得率（28）。吸附型色譜復(fù)性是在變性條件下，利用變性蛋白質(zhì)可瞬間結(jié)合在特定層析介質(zhì)上的特性，進(jìn)行緩沖液的交換，降低變性劑的濃度，可先改變變性劑濃度使吸附的蛋白質(zhì)逐漸的折疊復(fù)性，在柱中的變性劑溶液完全被置換成折疊緩沖液后，再通過在折疊緩沖液中加入鹽或其它添加劑進(jìn)行原位純化洗脫，為了獲得好的折疊效率和純化效率，常采用梯度洗脫或階段洗脫的方法。多肽通過在N端或C端加上一個親和標(biāo)簽，在包涵體的純化上有兩個方面的用途，其一是包涵體變性溶解后，利用親和色譜直接進(jìn)行包涵體溶液的純化，再用稀釋或透析的方法進(jìn)行復(fù)性(55,57,60,64,65,68)，其二就是用于親和色譜復(fù)性(61,66,67,69,70)。C. 由固定化伴侶分子和/或折疊酶介導(dǎo)的色譜復(fù)性在單鏈Fv段的透析復(fù)性中，加入固定化的氧化還原酶DsbA和DsbC可以顯著提高折疊的效率，得到的單鏈Fv段和天然Fv段具有相同的功能（46）。大部分的可溶性重組蛋白在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)，而一些膜蛋白常常表達(dá)于細(xì)胞內(nèi)膜上，還有一些則分泌到細(xì)菌的周質(zhì)間隙或細(xì)胞外。 層析技術(shù)在分離純化中的應(yīng)用在過去的幾十年里各種層析用基質(zhì)得到發(fā)展，如Sephacryl、Sepharose FF、 Sepharose HP、Superose、Superdex、SOURCE、Mono Beads、Toyopearl，這些基質(zhì)都有其的物理和化學(xué)特點，在蛋白質(zhì)的分離純化中發(fā)揮著重要的作用。在重組蛋白的分離純