【正文】 并且伴隨有自由能和熵的變化，蛋白質(zhì)最終尋找到自己的正確的折疊結(jié)構(gòu)，這一理論稱為能量圖景（energy landscape），如圖3所示，漏斗下方的凹凸反映蛋白質(zhì)構(gòu)象瞬間進(jìn)入局部自由能最小區(qū)域(13,14)。這一理論認(rèn)為結(jié)構(gòu)同源的蛋白質(zhì)可以通過不同的折疊途徑形成相似的天然構(gòu)象，人酸性成纖維生長因子（hFGF1）和蠑螈酸性成纖維生長因子（nFGF1）氨基酸序列具有約80%同源性，并且具有結(jié)構(gòu)同源性（12個β折疊反向平行排列形成β折疊桶），在鹽酸胍誘導(dǎo)去折疊的過程中，hFGF1可以監(jiān)測到具有熔球體樣的折疊，而nFGF1經(jīng)由兩態(tài)（天然狀態(tài)到變性狀態(tài)）去折疊，沒有檢測到的存在，折疊的動力學(xué)研究也表明兩種蛋白采用不同的折疊機(jī)制（38）。這兩個例子都說明折疊機(jī)制的復(fù)雜性，也與上面所介紹的理論相吻合。 包涵體的分離和溶解細(xì)胞破碎后，通過離心的方法可以很方便的回收包涵體，再用洗滌液（通常含有低濃度的變性劑，表面活性劑，還原劑，EDTA）對包涵體進(jìn)行清洗，就可以得到較純的包涵體（4，74）。由于鹽酸胍溶解包涵體蛋白質(zhì)能力比尿素強(qiáng)，而且尿素中的異氰酸酯可以使自由氨基氨甲?；ㄟ@種作用在堿性條件下表現(xiàn)的更強(qiáng)），所以常常首選鹽酸胍作為解離劑。除此之外，改變pH和使用表面活性劑也被用于溶解包涵體蛋白質(zhì)（22），相對而言，這兩種方法的應(yīng)用較少，而且只有具有正確二硫鍵的包涵體蛋白質(zhì)才可以用表面活性劑進(jìn)行溶解，否則可同時形成正確的和非正確的二硫鍵，表明用尿素、鹽酸胍變性和用表面活性劑變性對蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和動力學(xué)有不同的影響，Tsumoto在這方面做了詳細(xì)的論述（25）。Panda等在高pH 條件下使用低濃度的尿素溶解包涵體蛋白質(zhì)，用于重組牛生長激素、重組人生長激素和獼猴透明帶糖蛋白的變復(fù)性，認(rèn)為在變性時蛋白質(zhì)所保留的天然二級結(jié)構(gòu)有助于蛋白的折疊，減少蛋白質(zhì)的聚集。聯(lián)合使用高壓和低濃度的變性劑已用于包涵體蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)聚集體的變性，是一種有前景的變性方法（31,83)。 溶解后包涵體蛋白質(zhì)的折疊復(fù)性已經(jīng)發(fā)展了很多的方法用于包涵體的折疊復(fù)性，但是這些方法的結(jié)果并不可預(yù)測，每一種方法都需要對各種實(shí)驗條件，如變性劑濃度、pH、溫度、蛋白質(zhì)濃度、離子強(qiáng)度、添加劑的濃度，進(jìn)行優(yōu)化選擇。但由于包涵體還含有其它的細(xì)胞成分，如膜蛋白、磷脂、核酸，可能影響蛋白質(zhì)的復(fù)性（53,54），為了進(jìn)一步提高純度，有些研究工作在包涵體變性后先進(jìn)行蛋白的純化，如親和層析（47,55,57,60,63,64,65, 68）、離子交換層析（47,56）、凝膠過濾層析、反相層析（62），再進(jìn)行變性蛋白質(zhì)的復(fù)性，層析在變性條件下應(yīng)用為這一策略提供了技術(shù)支持。為了控制折疊、錯誤折疊和聚集的速率，一種方法是降低變性劑的濃度，降低的速度和操作的時間都決定折疊的效率。甘油，對蛋白質(zhì)具有優(yōu)先的水合作用/增加黏度甘氨酰甜菜堿/山梨糖醇，對蛋白質(zhì)具有優(yōu)先的水合作用木糖醇，增加黏度DMSO，調(diào)節(jié)極性Triton X100，保護(hù)非極性表面蔗糖/海藻糖，對蛋白質(zhì)具有優(yōu)先的水合作用/增加黏度三氟乙醇（TFE），促進(jìn)二級結(jié)構(gòu)的形成低濃度尿素，使部分折疊的不穩(wěn)定/增加天然構(gòu)象蛋白質(zhì)的溶解性聚乙二醇，保護(hù)熔球體（molten globule）/增加黏度在折疊過程中另一個關(guān)鍵的問題是正確二硫鍵的形成，一旦形成了錯誤的二硫鍵，就不能再折疊形成正確的結(jié)構(gòu)，所以在折疊時不僅要氧化促進(jìn)二硫鍵的形成，還要加入還原劑促進(jìn)二硫鍵改組（disulfidebond reshuffling），使蛋白質(zhì)最終折疊成正確的結(jié)構(gòu)。3 在復(fù)性前將巰基保護(hù)起來，有兩種方法可以選擇，一是通過谷胱甘肽和蛋白的半胱氨酸殘基形成二硫鍵來保護(hù)巰基，二是進(jìn)行半胱氨酸磺酸化，從而減少復(fù)性過程中不正確的二硫鍵的形成，復(fù)性后再加入還原劑使形成正確二硫鍵。人絨毛膜促性腺激素β亞基（hCGβ）含有12個半胱氨酸殘基，如果不進(jìn)行巰基保護(hù)，在折疊復(fù)性中會形成寡聚體和大量沉淀，變性蛋白質(zhì)磺酸化后再折疊復(fù)性可形成幾乎100%單體蛋白，同時提高了得率和純度（37）。用折疊緩沖液快速稀釋溶解的包涵體蛋白質(zhì)溶液，達(dá)到降低變性劑濃度的目的，使去折疊的蛋白質(zhì)進(jìn)行再折疊，就是稀釋復(fù)性。折疊進(jìn)行時的蛋白質(zhì)濃度是體外折疊成功的關(guān)鍵，理想的情況是希望折疊在高濃度的條件下進(jìn)行，但是在高濃度的條件下變性劑的稀釋常常造成去折疊和部分折疊蛋白質(zhì)的聚集。變性劑濃度的降低也可以分階段的進(jìn)行，或先經(jīng)過稀釋，再透析去除剩余的變性劑，由于變性劑的濃度在開始時先降到一定的水平，增加了部分折疊的溶解性，常?？梢蕴岣哒郫B的效率，但是必須通過實(shí)驗選擇在不同階段使用的變性劑濃度，避開圖2 所示的c區(qū)段。Tsumoto等通過分階段透析進(jìn)行了單鏈Fv段包涵體的折疊復(fù)性，在1M鹽酸胍透析時加入氧化型谷胱甘肽和L精氨酸可以使正確折疊蛋白的得率達(dá)到95% 以上（40），進(jìn)一步研究表明在1M鹽酸胍條件下蛋白質(zhì)所具有的結(jié)構(gòu)使得自由巰基容易形成正確的二硫鍵，加入氧化型谷胱甘肽的作用是加速了蛋白質(zhì)的正確折疊、抑制蛋白質(zhì)的聚集，而L精氨酸起的作用是穩(wěn)定部分折疊的使其不發(fā)生聚集，所以同時加入氧化型谷胱甘肽和L精氨酸可以將蛋白質(zhì)的聚集降到最低的程度（41）。Arora等將這一方法用于人γ干擾素的復(fù)性，產(chǎn)品的得率和比活比文獻(xiàn)報道的都要高（72）。在已經(jīng)發(fā)展的復(fù)性方法中，稀釋復(fù)性仍然是應(yīng)用最多的方法，但在放大時會因為處理體積太大造成成本太高。擴(kuò)張床吸附技術(shù)可以處理大量的樣品，而且分離的效能不受聚集蛋白質(zhì)的影響，F(xiàn)erre等將蛋白質(zhì)的稀釋折疊和擴(kuò)張床吸附捕獲技術(shù)相偶聯(lián)，使用STREAMLINETM DEAE陰離子交換介質(zhì)，用于包涵體蛋白質(zhì)HAThβ2m的分離純化，可以得到48%回收率和94%純度的復(fù)性蛋白（23）。色譜方法不僅在蛋白質(zhì)的純化中得到廣泛應(yīng)用，也成為包涵體蛋白質(zhì)復(fù)性的主要手段之一。第一類型的色譜復(fù)性就是凝膠過濾色譜復(fù)性，這一方法的原理在于通過分子篩效應(yīng)可將蛋白質(zhì)和小分子的變性劑分離，實(shí)現(xiàn)溶液交換和蛋白質(zhì)的折疊。對于一些稀釋法難于折疊的蛋白質(zhì)，這一方法具有更好的效果，如一些膜蛋白（24,50,71）。另一種方法是在介質(zhì)上固定化伴侶分子或折疊酶，使層析柱成為一個折疊反應(yīng)器，固定化的優(yōu)點(diǎn)是能夠回收使用，不會引入新的雜蛋白。A. 凝膠過濾色譜復(fù)性血小板衍生的生長因子（PDGF）由兩個亞基組成，M252。通常選擇線性的梯度用于折疊復(fù)性，對于不同的蛋白質(zhì)還有其它的模式，如一些蛋白在特定的變性劑濃度范圍里不穩(wěn)定，在此變性劑濃度范圍里就需要快速降低變性劑濃度。通過尿素線性梯度復(fù)性，變性溶菌酶以高蛋白濃度上樣（17mg/ml）可以獲得90%的活性回收率，與稀釋復(fù)性和非梯度凝膠過濾復(fù)性相比較，顯著的改善了活性回收率（27）。另外應(yīng)用連續(xù)環(huán)形色譜，蛋白樣品連續(xù)上樣于旋轉(zhuǎn)的色譜柱上，在提高折疊效率的同時，也提高了色譜復(fù)性處理的能力（29,30）。B. 吸附型色譜復(fù)性由于蛋白質(zhì)結(jié)合在固相介質(zhì)上，減少了折疊過程中由于分子間相互作用所造成的聚集，所以這一方法可提高折疊的效率。由于蛋白質(zhì)或肽類標(biāo)簽在變性條件大多失去了與親和介質(zhì)結(jié)合的特性，目前這一技術(shù)用的最多的是組氨酸標(biāo)簽。Stempfer等在α葡萄糖苷酶的N端或C端加上多聚精氨酸標(biāo)簽，研究了變性蛋白在肝素親和介質(zhì)上的折疊復(fù)性，通過優(yōu)化實(shí)驗條件，蛋白質(zhì)可以在5mg/ml濃度條件下高效復(fù)性(59)。除了以上的應(yīng)用，更令人鼓舞的是這一技術(shù)已成功用于膜蛋白的復(fù)性（24,50,71）。分子伴侶和折疊酶在蛋白質(zhì)的正確折疊中起著重要的作用，是近年來的一個研究熱點(diǎn)，它們和蛋白質(zhì)在體內(nèi)共表達(dá)已經(jīng)成為促進(jìn)蛋白質(zhì)可溶性表達(dá)的重要方法。Altamirano等通過固定化伴侶分子GroEL的活性小片段、脯胺酰異構(gòu)酶和大腸桿菌氧化還原酶DsbA將蝎子毒素蛋白Cn5的折疊得率從5%提高到87%（18）。近年，還有一些其它的方法用于蛋白質(zhì)的折疊復(fù)性，如雙水相萃取復(fù)性（76,77,78,79），反向膠束復(fù)性（33,75,80），高靜力壓復(fù)性（31,81,82,83），這些方法對特定的蛋白質(zhì)可獲得高的復(fù)性效率，大多還停留在研究階段，相信隨著方法的成熟和普及，將會為包涵體蛋白質(zhì)的折疊復(fù)性提供更多的選擇手段。蛋白質(zhì)釋放的方法依賴于蛋白質(zhì)最終在細(xì)胞中的定位。將重組蛋白分泌到周質(zhì)間隙或細(xì)胞外可避免破碎細(xì)胞和處理細(xì)胞碎片，而且雜蛋白的種類和量都要少得多（在周質(zhì)空間大約有100種不同蛋白質(zhì)，而在胞漿內(nèi)有大約4000種不同的蛋白）。對于表達(dá)于細(xì)胞內(nèi)膜和胞內(nèi)的蛋白質(zhì)要經(jīng)過細(xì)胞破碎，常用的方法有高壓勻漿法、超聲破碎法、珠磨法、化學(xué)滲透法和酶溶解法，每種方法有自己的特點(diǎn)，現(xiàn)在的研究常常將幾種方法結(jié)合，并緊密結(jié)合下游固液分離過程（87）。對于表達(dá)于細(xì)胞膜的蛋白質(zhì)，先要破碎細(xì)胞后分離細(xì)胞膜，再抽提溶液進(jìn)行膜蛋白的提取，由于膜蛋白具有疏水區(qū)域，在抽提溶液中需要加入表面活性劑，一方面破壞細(xì)胞膜，溶解膜結(jié)構(gòu)，另一方面促進(jìn)膜蛋白的溶解和穩(wěn)定，常用Triton X100、 脫氧膽酸鈉、Brij等弱的表面活性劑來保留蛋白質(zhì)的天然構(gòu)象。在膜蛋白的整個分離純化過程中，都要使用表面活性劑來模擬脂質(zhì)的功能，但膠束與蛋白質(zhì)的相互作用常常降低層析的分辨率，而且聚集的情況更容易發(fā)生，所以在特定的純化階段選擇哪一種表面活性劑，以及使用多大的濃度，對分離純化的影響最為關(guān)鍵（88）。釋放出目標(biāo)蛋白后，再進(jìn)行液相和固相細(xì)胞碎片的分離，得到澄清的蛋白質(zhì)溶液就可以進(jìn)行下游的分離純化了，涉及膜分離技術(shù)、沉淀分離技術(shù)、萃取技術(shù)、層析技術(shù)、電泳分離技術(shù)，以及一些整合技術(shù)，如擴(kuò)張床吸附，雙水相萃取。擴(kuò)張床吸附和雙水相萃取整合了細(xì)胞碎片處理過程和初步濃縮純化過程，在大規(guī)模純化重組蛋白時具有很強(qiáng)的優(yōu)勢。層析技術(shù)應(yīng)用于蛋白質(zhì)的分離純化開始于60年代，現(xiàn)在已成為蛋白質(zhì)分離純化的高分辨的方法。由于蛋白質(zhì)大分子具有高的親水性，要求分離介質(zhì)具有親水的界面，為活性大分子提供適宜的微環(huán)境，早期的離子交換介質(zhì)不具有親水的特性和大的孔結(jié)構(gòu)，僅用于小分子的分離純化，Peterson 和 Sober 等在離子交換介質(zhì)的研究上進(jìn)行了開拓性的工作，選擇特定的纖維素作為離子交換基團(tuán)的基質(zhì)，合成的離子交換纖維素介質(zhì)具有高的結(jié)合容量和低的不可逆性吸附，并得到實(shí)際應(yīng)用（89,90）。層析技術(shù)的另一個發(fā)展方向是功能基團(tuán)的發(fā)展，適應(yīng)不同的選擇性要求，如各種不同親和層析介質(zhì)的合成，使一步純化就能達(dá)到很高的純度。凝膠過濾層析是基于液相的分離方法，凝膠包裹的內(nèi)環(huán)境形成固定相，凝膠的外環(huán)境形成流動相，蛋白質(zhì)分子越大越不容易滲透進(jìn)入固定相，所以又稱為分子篩層析，層析的分辨率與介質(zhì)的排阻極限和上樣的體積有關(guān)，是一種易于操作的層析方法，另外凝膠過濾層析常用于緩沖液交換，此時可使用較大的載量。疏水層析基于蛋白質(zhì)表面的疏水區(qū)和介質(zhì)疏水配體間的相互作用，在高鹽濃度條件下，蛋白質(zhì)的疏水區(qū)表面上有序排列的水分子通過鹽離子的破壞作用釋放，裸露的疏水區(qū)與疏水配體相互作用而被吸附，隨著鹽濃度的降低，疏水性相互作用也降低，蛋白質(zhì)的水化層又形成，蛋白質(zhì)最終解吸附，其它物質(zhì)，如乙二醇、甘油、非離子表面活性劑也可以降低疏水相互作用，而且疏水相互作用也受pH、溫度和添加劑的影響。羥基磷灰石層析常用于的分離純化，對其分離的機(jī)制還了解的不清楚，但涉及介質(zhì)上鈣離子和磷酸根與蛋白上帶電殘基的相互作用。等點(diǎn)聚焦層析是基于蛋白質(zhì)等電點(diǎn)不同的分離模式，以陰離子交換劑為固定相的情況為例，兩性電解質(zhì)緩沖液和離子交換基團(tuán)相互作用形成pH梯度，蛋白質(zhì)在pH 大于其等電點(diǎn)時吸附，在pH低于其等電點(diǎn)時解吸附，由于蛋白質(zhì)區(qū)帶后部所處微環(huán)境的pH總是低于蛋白質(zhì)區(qū)帶前部所處微環(huán)境的pH，處于后部區(qū)帶的蛋白質(zhì)先于前部開始移動，從而產(chǎn)生聚焦效應(yīng)。利用DNA重組技術(shù)，進(jìn)行目標(biāo)蛋白的融合表達(dá)，再用親和層析進(jìn)行分離純化，已經(jīng)成為蛋白質(zhì)表達(dá)純化的常用手段。蛋白質(zhì)能否獲得高效分離純化既與層析介質(zhì)的理化性質(zhì)（如配基組成、配基密度、孔徑、表面積、顆粒大小、顆粒分散性）有關(guān)，又與流動相參數(shù)（如有機(jī)溶劑、pH、金屬離子、解離劑、氧化/還原劑、溫度、緩沖液組成、離子強(qiáng)度、上樣濃度和體積）有關(guān)，正是這些理化參數(shù)的變化使得層析技術(shù)具有更強(qiáng)的通用性，成為最重要的蛋白質(zhì)分離純化技術(shù)，表3 列出常用層析方法的分離特點(diǎn)和在不同純化階段的應(yīng)用情況（94）。 親和標(biāo)簽的在重組蛋白分離純化中的應(yīng)用從分離的機(jī)理上來講，親和層析是一種典型的吸附層析，分子與其介質(zhì)上的配體結(jié)合具有特異性和可逆性，特異性使純化具有選擇性，而可逆性使蛋白質(zhì)在適宜的條件下洗脫下來。除了方便分離純化，親和標(biāo)簽的融合表達(dá)還有以下的優(yōu)點(diǎn)：但要注意的是可溶性表達(dá)并不能保證正確的折疊，融合蛋白可以形成可溶性的聚集體（106）。2. 加入的標(biāo)簽提供檢測目標(biāo)蛋白的高靈敏度方法，如表位標(biāo)簽可以使用ELISA和Western blotting 進(jìn)行定性和定量檢測。3. 親和融合策略已廣泛用于蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)相互作用研究和蛋白質(zhì)復(fù)合物研究（99）。4. 改善蛋白的藥代和藥動學(xué)特性，如一些細(xì)胞因子和免疫球蛋白G（IgG）的Fc段融合，可以性顯著增加半衰期，與白蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合也可以起到相同的效果。1. 親和標(biāo)簽是否會影響到目標(biāo)蛋白的結(jié)構(gòu)和功能大多數(shù)情況首選短的多肽標(biāo)簽，這是因為短的肽標(biāo)簽對目標(biāo)蛋白的結(jié)構(gòu)影響最小，在某些應(yīng)用中，短肽不必要去除，因為重組蛋白已經(jīng)具有完全的生物學(xué)功能，這也是6 個組氨酸標(biāo)簽比GST標(biāo)簽應(yīng)用更廣的原因，而且短肽不具有免疫原性，融合蛋白可直接的用于的制備；而大的親和標(biāo)簽可能限制重組蛋白的折疊，影響蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能。含有多對二硫鍵的蛋白質(zhì)或