【正文】 達(dá)和表達(dá)形成包涵體各有利弊，對許多蛋白，再折疊很困難，或者不可能，進(jìn)行可溶性的表達(dá)就是首選。蛋白質(zhì)的糖基化可以影響到蛋白質(zhì)的折疊行為和溶解性，當(dāng)它們在原核系統(tǒng)進(jìn)行表達(dá)時(shí)，也容易聚集（4）。盡管如此，限制折疊速率的結(jié)構(gòu)特性，如二硫鍵的形成常常是含有二硫鍵蛋白質(zhì)正確折疊的限速步驟（并不絕對，因?yàn)橛行┑鞍踪|(zhì)二硫鍵的破壞并不影響其功能），富含二硫鍵的蛋白質(zhì)具有更為復(fù)雜的結(jié)構(gòu)，當(dāng)高水平表達(dá)時(shí)，由于大腸桿菌細(xì)胞質(zhì)是一個(gè)偏還原性的環(huán)境，蛋白質(zhì)容易形成錯(cuò)配的二硫鍵，這常常是包涵體形成的主要原因。強(qiáng)的表達(dá)系統(tǒng)，高的誘導(dǎo)劑濃度，相對較高的培養(yǎng)溫度常常造成包涵體的形成。細(xì)菌如大腸桿菌可以在短時(shí)間里得到高水平表達(dá)的蛋白質(zhì)，但同時(shí)表達(dá)的蛋白質(zhì)常常形成非活性的包涵體。 包涵體蛋白質(zhì)的折疊復(fù)性生產(chǎn)上使用的非線性色譜，如置換色譜，一次層析的載量很大，得到的蛋白純度很高，近年來也有很大的發(fā)展和應(yīng)用（85,36）。另外這兩種技術(shù)和親和相互作用結(jié)合可進(jìn)一步提高處理的選擇性。在工業(yè)上，為了盡可能提高過程的通量和減少生產(chǎn)的成本，發(fā)展的方法與傳統(tǒng)的方法不同。在這一階段的純化中，鹽析沉淀仍然應(yīng)用，但共沉淀的雜質(zhì)常常很多，離子交換層析和疏水層析具有操作上的優(yōu)點(diǎn)，可以再生使用，成為這一步通常選用的層析方法；中間階段純化是最為關(guān)鍵的階段，這時(shí)要能達(dá)到和大量的雜蛋白分離，利用蛋白質(zhì)不同的性質(zhì)選擇不同的純化方法，每一步的方法要有足夠的選擇性，提高目標(biāo)蛋白質(zhì)的純度；最后進(jìn)行精制純化，常用凝膠層析，使目標(biāo)蛋白的純度進(jìn)一步提高達(dá)到要求。在下游的純化工藝中為了提高蛋白的得率和處理的效率，應(yīng)當(dāng)使用最少的純化步驟，經(jīng)典的純化過程如圖1 所示。所以在分離純化的開始階段，要盡可能的了解目標(biāo)蛋白的特性，不僅如此還要了解所存在雜質(zhì)成分的性質(zhì)，如大腸桿菌的蛋白大多是一些低分子量的蛋白（50000Da），而且酸性蛋白較多；3 在純化的早期階段要盡量減少處理的體積，方便后續(xù)的純化；4 在純化的后期階段，再使用造價(jià)高的純化方法，這是因?yàn)樘幚淼牧亢碗s質(zhì)的量都已減少，有利于昂貴純化材料的重復(fù)使用，減少再生的復(fù)雜性（84）。凝膠過濾層析用于后續(xù)的精制步驟，如去除少量的雜蛋白或聚合體，在純化過程中用于脫鹽和緩沖液交換。下游的分離純化步驟不僅要在可替換的分離技術(shù)間進(jìn)行選擇，如細(xì)胞的破碎可選擇高壓勻漿法、高速珠磨法、超聲破碎或酶溶法，分離細(xì)胞、細(xì)胞碎片、包涵體和沉淀物，可選擇離心或過濾，需要進(jìn)行濃縮的時(shí)候，可選擇沉淀或超濾；另一方面，設(shè)計(jì)的純化工藝包括特定的層析步驟，及層析的先后順序，以期得到最大的得率。1.Richard等在純化重組大腸桿菌RNA聚合酶σ32亞基的工作中給出了很好的范例，在定量測定項(xiàng)中，包括了蛋白質(zhì)的定量測定、定量SDSPAGE、定量蛋白質(zhì)斑點(diǎn)印跡和酶活測定，使用這些方法對操作的每一個(gè)階段取樣進(jìn)行純化效果的評價(jià)，從而確保每一步純化的有效性（1）。另外當(dāng)一些蛋白沒有方便可用的生物學(xué)活性測定方法，或者由于干擾物質(zhì)的存在不能測活，可應(yīng)用一些免疫學(xué)的方法進(jìn)行檢測。在分離純化的每一步，都需要對蛋白和活性進(jìn)行定量，這就要求分析方法有準(zhǔn)確可定量的特點(diǎn)，以對分離純化的效果進(jìn)行評價(jià)?？焖賱t要求能很快的給出定性和定量結(jié)果，以便更好的與分離純化的工作相銜接。在理想的情況下，我們希望所選擇的分析方法具有特異、快速、靈敏和可定量的特點(diǎn)。在進(jìn)行任何純化工作時(shí)，第一步必須針對目標(biāo)蛋白建立特異性的分析方法。這一點(diǎn)在分離純化和蛋白質(zhì)儲(chǔ)存中都很重要，影響蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的因素有溫度、pH、離子強(qiáng)度、某些添加劑、表面吸附、震搖、剪切力、凍融、蛋白濃度、壓力等，這些因素對折疊的影響有的是可逆的，有的是不可逆的，而且相互之間也有影響，在實(shí)際處理中應(yīng)選擇合適的條件，盡量避免不利因素的影響（2），并利用活性跟蹤的方法對處理進(jìn)行評價(jià)，指導(dǎo)分離純化。蛋白質(zhì)的構(gòu)象穩(wěn)定性可以通過測定蛋白質(zhì)變性反應(yīng)時(shí)折疊（f）和去折疊（u）間自由能的變化（ΔGf→u）來衡量，ΔGf→u越大蛋白質(zhì)就越穩(wěn)定。蛋白質(zhì)的功能依賴于蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，對于有生物活性的蛋白質(zhì)，在分離純化過程中必須根據(jù)目標(biāo)蛋白的特點(diǎn)，采用合適的操作條件和方法，保證目標(biāo)蛋白的活性盡量不損失。當(dāng)然對目標(biāo)蛋白純度的要求要根據(jù)純化蛋白的用途而定，對于治療性的蛋白要求有大于99%的純度，并對處方有活性和穩(wěn)定性的要求，對于某些酶的純度則要求較低，需要在純度和得率之間進(jìn)行一個(gè)平衡，所以下游的工藝流程取決于最終對目標(biāo)蛋白的要求。在這樣一個(gè)混合體系中，蛋白質(zhì)純化要求將目標(biāo)蛋白與其它的成分分離，得到一定的量，達(dá)到一定的純度，同時(shí)要盡可能保留蛋白的生物活性，并使蛋白保持完整。胞內(nèi)可溶性蛋白表達(dá)包涵體易于分離，保護(hù)蛋白質(zhì)不被降解，蛋白質(zhì)不具有活性對宿主細(xì)胞生長沒有大的影響，通?？色@得高的表達(dá)水平好些蛋白不能分泌進(jìn)入周質(zhì)空間，沒有大規(guī)模選擇性的釋放周質(zhì)空間蛋白的技術(shù)，周質(zhì)蛋白酶可引起重組蛋白酶解細(xì)胞周質(zhì)空間表達(dá)增強(qiáng)正確二硫鍵的形成，降低蛋白酶對表達(dá)蛋白的降解，可獲得確定的N末端，顯著減少雜蛋白水平，簡化純化，不需要細(xì)胞破碎重組蛋白不同表達(dá)策略的優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)選擇將所表達(dá)的蛋白分泌到細(xì)胞外或周質(zhì)空間可以避免破碎細(xì)胞的步驟，并且由于蛋白質(zhì)種類少，目標(biāo)蛋白容易純化；而在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)表達(dá)蛋白，可能是可溶性表達(dá)，可能形成包涵體，可溶性的蛋白往往需要復(fù)雜的純化步驟，而包涵體易于分離，純度較高，但回收具有生物活性的蛋白卻變的相當(dāng)困難，需要對聚集的蛋白進(jìn)行變復(fù)性，通?；钚缘鞍椎牡寐时容^低，表1列出了不同策略對表達(dá)、純化的影響，對于其中的有些缺點(diǎn)可以通過一定的方法進(jìn)行克服和避免，如利用DNA重組技術(shù)給外源蛋白加上一個(gè)親和純化的標(biāo)簽，有助于可溶性外源蛋白的選擇性純化，并能保護(hù)目標(biāo)蛋白不被降解（96）。分離純化組成了基因工程的下游處理（downstream processing）階段，這一過程又和上游過程緊密相聯(lián)系，上游過程的諸方面影響到下游的分離純化，所以在進(jìn)行目標(biāo)蛋白質(zhì)表達(dá)純化時(shí)要統(tǒng)一考慮和整體設(shè)計(jì)，并充分考慮上游因素對下游的影響，如是否帶有親和標(biāo)簽，是否進(jìn)行分泌表達(dá)。重組蛋白和多肽的分離純化1.概述目前應(yīng)用最廣泛的表達(dá)系統(tǒng)有三大類，分別是大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)、表達(dá)系統(tǒng)和CHO細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)，不同的表達(dá)系統(tǒng)和培養(yǎng)方法顯著影響下游的處理過程，目標(biāo)蛋白表達(dá)是否形成包涵體，目標(biāo)蛋白表達(dá)的定位（胞內(nèi)、細(xì)胞內(nèi)膜、周質(zhì)空間和胞外），蛋白表達(dá)的量都依賴于所選擇的表達(dá)系統(tǒng)。分泌表達(dá)至細(xì)胞外表達(dá)水平低，多數(shù)蛋白不能進(jìn)行分泌表達(dá)，表達(dá)蛋白需要進(jìn)行濃縮增強(qiáng)正確二硫鍵的形成，可獲得確定的N末端，顯著減少雜蛋白水平，簡化純化胞內(nèi)包涵體表達(dá)需要體外的折疊和溶解，得率較低，具有不確定N末端不需要體外溶解和折疊，一般具有正確的結(jié)構(gòu)和功能高水平的表達(dá)常難以得到，需要復(fù)雜的純化，可發(fā)生蛋白質(zhì)的酶解，具有不確定的N末端在細(xì)胞的提取物中，除了目標(biāo)蛋白外，還含有其它各種性質(zhì)的蛋白、核酸、多糖等。所以蛋白質(zhì)的分離純化可以看作是一系列的分部收集過程，總是希望目標(biāo)蛋白富集于其中的一個(gè)收集部位，而大量的雜蛋白存在于其它的收集部位。除了在分離純化的初期，要采用快速的方法除去影響目標(biāo)蛋白穩(wěn)定性的雜質(zhì)，還要嚴(yán)格控制涉及蛋白質(zhì)變性的各種因素，來避免蛋白質(zhì)失去活性。根據(jù)報(bào)導(dǎo)蛋白質(zhì)的ΔGf→u在5—20kcal/mol范圍之間，—2kcal/mol自由能的變化，—，因此ΔGf→u相對比較小，這樣天然狀態(tài)僅僅比去折疊狀態(tài)穩(wěn)定一點(diǎn)，所以必須克服蛋白質(zhì)內(nèi)在的不穩(wěn)定性，保留蛋白的活性。這些特異性的分析方法都是基于目標(biāo)蛋白的一些特性，如酶的活性，免疫學(xué)活性，物理特性（如分子量、等電點(diǎn)、光譜學(xué)特征等），生物學(xué)活性。特異性要求分析方法反映目標(biāo)蛋白的獨(dú)特性，以排除假陽性。靈敏的分析方法僅需要少量的樣品，這就給操作帶來了極大的方便。如通過SDSPAGE電泳測定蛋白質(zhì)分子量來鑒定蛋白質(zhì)，由于電泳的分辨率限制，常常不能確定收集部位中是否含有目標(biāo)蛋白或目標(biāo)蛋白是否得到了富集，這時(shí)就需要運(yùn)用更特異的分析方法，如Western blotting就可以從復(fù)雜的混合物中描述蛋白的分子量，并對蛋白進(jìn)行定量。在純化的過程中，需要監(jiān)測以下幾個(gè)參數(shù)：總的樣品體積，樣品中總的蛋白，目標(biāo)蛋白的活性單位，通過這些基本的信息，就可以跟蹤每步純化的效率，計(jì)算出目標(biāo)蛋白的回收率，目標(biāo)蛋白的比活性，以及純化的倍數(shù)，從而對純化的每一步，乃至整個(gè)流程進(jìn)行定量評價(jià)。正是由于分析方法在分離純化中的指導(dǎo)性作用，所以有效的分析方法是分離純化是否能夠成功的前提。分離純化的方法策略及其應(yīng)用吸附層析，如離子交換層析，疏水層析和親和層析，可基于特定的選擇性達(dá)到對目標(biāo)蛋白的純化，適用于大量樣品的處理。在分離純化中對每個(gè)步驟的選擇，可以遵循以下原則：1 應(yīng)盡可能的利用蛋白質(zhì)的不同物理特性選擇所用的分離純化技術(shù)，而不是利用相同的技術(shù)進(jìn)行多次純化；2不同的蛋白質(zhì)在性質(zhì)上有很大的不同，這是能從復(fù)雜的混合物中純化出目標(biāo)蛋白的依據(jù)，每一步純化步驟應(yīng)當(dāng)充分利用目標(biāo)蛋白和雜質(zhì)成分物理性質(zhì)的差異。在初始的純化階段，除了使目標(biāo)蛋白和細(xì)胞內(nèi)的DNA、RNA、多糖以及性質(zhì)差別較大的蛋白質(zhì)成分分離，采用的分離方法要能除去影響目標(biāo)蛋白穩(wěn)定性的雜質(zhì)，保護(hù)目標(biāo)蛋白不被蛋白酶降解，進(jìn)行目標(biāo)蛋白的捕獲和濃縮。對于包涵體蛋白質(zhì)，由于涉及包涵體蛋白質(zhì)的變復(fù)性，其純化步驟和方法與可溶性蛋白不同，需要對每一種包涵體蛋白質(zhì)建立相應(yīng)的復(fù)性方法，將在后面作介紹。圖1 經(jīng)典的蛋白質(zhì)純化流程圖雙水相萃取和擴(kuò)張床吸附技術(shù)，可以處理全液，通過整合技術(shù)的使用，能達(dá)到萃取、濃縮和初步純化的目的。相似的，親和相互作用還可以整合進(jìn)其它的高通量處理，如親和膜過濾和親和沉淀（2）。在過去幾十年的發(fā)展過程中，重組DNA技術(shù)為大規(guī)模生產(chǎn)目標(biāo)蛋白提供了新的途徑，盡管有不同的宿主系統(tǒng)可供選擇，如果翻譯后修飾不是蛋白質(zhì)功能所必需的話，大腸桿菌和其它的原核宿主系統(tǒng)仍然是生產(chǎn)重組蛋白的首選(17)。包涵體的形成是一個(gè)由許多蛋白質(zhì)參與的極端復(fù)雜的動(dòng)力學(xué)過程，依賴于蛋白質(zhì)的折疊速率和聚集速率，并且與蛋白質(zhì)的合成和降解程度相關(guān)（35）。除了外界因素，包涵體的形成依賴于蛋白質(zhì)特異的折疊行為，而不是蛋白的通常特性，如大小，融合標(biāo)簽，相對的疏水性。膜蛋白具有暴露的疏水區(qū)，表達(dá)時(shí)易于聚集形成包涵體，也有可能由于降解或?qū)?xì)胞的毒性作用使得表達(dá)水平極低（45）?，F(xiàn)在發(fā)展了許多方法減少包涵體的形成，如使用中等強(qiáng)度或弱的啟動(dòng)子，低溫培養(yǎng)，有限的誘導(dǎo)，優(yōu)化培養(yǎng)基條件，進(jìn)行融合表達(dá)(49)，與伴侶分子和折疊酶共表達(dá)(3,5)，表達(dá)定位于不同的空間(7,58)，選擇突變的菌株（6,43）或其他的原核表達(dá)系統(tǒng)(34)。所以如果包涵體蛋白可以進(jìn)行體外的正確折疊，那么形成包涵體就可以接受，對易受細(xì)菌蛋白酶降解的蛋白質(zhì)或?qū)?xì)菌有毒性的蛋白質(zhì)來說，表達(dá)產(chǎn)生包涵體是絕對必要的。采用表達(dá)系統(tǒng)，可直接產(chǎn)生具有活性的蛋白質(zhì)，但是表達(dá)的水平和蛋白質(zhì)的回收率較低，采用大腸桿菌表達(dá)則形成包涵體，包涵體蛋白質(zhì)的折疊復(fù)性非常困難，改善蛋白質(zhì)的折疊復(fù)性具有實(shí)際的應(yīng)用意義。所以如果對于包涵體蛋白質(zhì)，通過機(jī)制的研究，能夠解決折疊復(fù)性的問題，那么利用包涵體的高水平表達(dá)，就可以得到大量的蛋白質(zhì)，降低生產(chǎn)的成本。在包涵體蛋白質(zhì)的變復(fù)性中，不管是采用什么方法進(jìn)行折疊，都要用變性劑溶解包涵體，最終又都要去除變性劑，理解變性劑對蛋白質(zhì)的影響可以指導(dǎo)我們設(shè)計(jì)復(fù)性過程。圖2：在各種變性劑濃度條件下蛋白質(zhì)的溶解性和構(gòu)象。如圖2所示，隨著變性劑濃度的變化，不僅具有天然構(gòu)象狀態(tài)蛋白質(zhì)的比率在改變，而且蛋白質(zhì)的溶解性也在改變。在低的變性劑濃度條件下，如圖2中a區(qū)段所示，天然構(gòu)象的蛋白質(zhì)是穩(wěn)定的，但也會(huì)穩(wěn)定部分折疊的中間體，這些部分折疊的易于自我締合形成沉淀。避免選擇c區(qū)段所在的條件進(jìn)行折疊，因?yàn)檫@一區(qū)段天然和變性的蛋白質(zhì)都只有有限的溶解性，折疊速度也很慢（13）。在高的變性劑濃度，蛋白質(zhì)是去折疊的，充分溶劑化的，柔性的，在折疊緩沖溶液中，蛋白質(zhì)是折疊的，具有剛性的，將蛋白質(zhì)從高變性劑濃度條件變?yōu)檎郫B緩沖溶液，就會(huì)使蛋白質(zhì)坍塌形成緊湊的結(jié)構(gòu)，但蛋白的這一過程不總能有效進(jìn)行，常常存在錯(cuò)誤折疊和聚集，所以在包涵體的變復(fù)性過程中，除了要控制上面所講的參數(shù)，還有兩方面的參數(shù)需要控制，一是應(yīng)用添加劑，來促進(jìn)折疊、減少聚集，二是控制溶液的氧化還原狀態(tài)促進(jìn)二硫鍵的正確配對。通常從包涵體中回收活性蛋白質(zhì)包括三個(gè)步驟：包涵體的分離和洗滌，包涵體蛋白質(zhì)的溶解和溶解蛋白質(zhì)的再折疊。對蛋白質(zhì)折疊機(jī)理的研究，對保留蛋白質(zhì)活性，維持蛋白質(zhì)穩(wěn)定性和包涵體蛋白質(zhì)折疊復(fù)性都具有重要的意義(21)。這一理論有兩個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)：1蛋白質(zhì)的狀態(tài)處于去折疊和天然構(gòu)象的平衡中；2 天然構(gòu)象的蛋白質(zhì)處于熱力學(xué)最低的能量狀態(tài)。在蛋白質(zhì)的折疊過程中，有許多作用力參與，包括一些構(gòu)象的空間阻礙，范德華力，氫鍵的相互作用，疏水效應(yīng)，離子相互作用，多肽和周圍溶劑相互作用產(chǎn)生的熵驅(qū)動(dòng)的折疊（12,52），但對于蛋白質(zhì)獲得天然結(jié)構(gòu)這一復(fù)雜過程的特異性，我們還知之甚少，許多實(shí)驗(yàn)和理論的工作都在加深我們對折疊的認(rèn)識，但是問題仍然沒有解決。在折疊的機(jī)制研究上早期的理論認(rèn)為，折疊是從變性狀態(tài)通過中間狀態(tài)到天然狀態(tài)的一個(gè)逐步的過程，并對折疊中間體進(jìn)行了深入研究，認(rèn)為折疊是在熱力學(xué)驅(qū)動(dòng)下按單一的途徑進(jìn)行的。新的理論強(qiáng)調(diào)在折疊的初始階段存在多樣性，蛋白質(zhì)通過許多的途徑進(jìn)入折疊漏斗（folding funnel），從而折疊在整體上被描述成一個(gè)漏斗樣的圖像，折疊的動(dòng)力學(xué)過程被認(rèn)為是部分折疊的蛋白質(zhì)整體上的進(jìn)行性裝配，