【正文】 如果含有受體細胞的染色體 DNA的同源序列 ， 會發(fā)生高頻同源整合 ， 整合子占轉化子總數的 5080%。 營養(yǎng)缺陷型的互補基因 用于轉化子篩選的標記基因 顯性標記基因 顯性標記基因的編碼產物大都是毒性物質的抗性蛋白 aph 氨基糖苷轉移酶 抗 G418 cat 氯霉素乙酰轉移酶 抗氯霉素 dhfr 二氫葉酸還原酶 抗氨甲喋呤和磺胺 cup1 銅離子螯合物 耐受銅離子 suc2 蔗糖轉化酶 耐受高濃度蔗糖 ilv2 乙酰乳糖合成酶 抗硫酰脲除草劑 標記基因 編碼產物 遺傳表型 E 酵母的表達系統(tǒng) 6 外源基因在酵母中的表達 外源基因在酵母菌中表達的限制因素 酵母菌啟動子的可控性 酵母菌表達系統(tǒng)的選擇 酵母啟動子的可控性 pho4TSPHO5啟動子： 釀酒酵母 PHO5啟動子在培養(yǎng)基中游離磷酸鹽耗盡時才能打開； PHO4基因編碼產物是 PHO5啟動子的正調控因子； 因此，裝在 pho4TSPHO5啟動子下游的外源基因在 35℃ 時關閉， 23℃ 誘導 表達。 a1因子決定 a細胞特征表達a2因子阻遏 a細胞 特征表達a1a2阻遏 a細胞特征表達 編碼 a2因子的基因突變型hmla2102能產生 a2變體 ，它能滅活 a1， 同時阻遏 a型 酵母啟動子的可控性 釀酒酵母 超誘導型啟動子 GAL1 GAL7 GAL10 UAS GAL4 GAL80 半乳糖誘導效果不明顯，基因基底水平表達 GAL1 GAL7 GAL10 UAS GAL4 GAL80 半乳糖誘導時， GAL4高效表達， GAL GAL GAL10超高效表達 GAL10 Promoter 的半乳糖 利用酶系 由 G A L 1 G A L 7和 G A L 10 基因編碼 外源基因在酵母中表達的限制因素 外源基因穩(wěn)態(tài) mRNA的濃度 外源基因 mRNA的翻譯活性 酵母菌對密碼子的偏愛性 在釀酒酵母中 ， 高豐度的蛋白質 （ 如甘油醛 3磷酸脫氫酶 GAPDH、 磷酸甘油激酶 PKG、 乙醇脫氫酶 ADH） 中 96% 以上的氨基酸是由 25個密碼子編碼的。 釀酒酵母表達系統(tǒng)的最大問題在于其 超糖基化 能力，往往使得 有些重組蛋白（如人血清白蛋白等）與受體細胞緊密結合，而不能 大量分泌。 酵母表達系統(tǒng)的選擇 乳酸克魯維酵母的雙鏈環(huán)狀質粒 pKD1已被廣泛用作重組異源 蛋白生產的高效表達穩(wěn)定性載體 ， 即便在無選擇壓力的條件下 ， 也 乳酸克魯維酵母表達系統(tǒng) 能穩(wěn)定遺傳 40代以上。 酵母表達系統(tǒng)的選擇 巴斯德畢赤酵母是一種 甲基營養(yǎng)菌 ， 能在低廉的含甲醇培養(yǎng)基中生 巴斯德畢赤酵母表達系統(tǒng) 長 ， 甲醇 可高效誘導甲醇代謝途徑中各酶編碼基因的表達 ， 因此生長迅 速 、 乙醇氧化酶基因 AOX1所屬強啟動子 、 表達的可誘導性是巴斯德畢 赤酵母表達系統(tǒng)的三大優(yōu)勢。 由于巴斯德畢赤酵母沒有合適的自主復制型載體 ， 所以外源基因的 表達序列一般 整合 入受體的染色體 DNA上 。 高效表達在很大程度上取決于整合 拷貝數 的多寡 。 其自主復制序列 HARS已被克 多型漢遜酵母表達系統(tǒng) 隆 ， 并用于構建克隆表達載體 ， 但與巴斯德畢赤酵母相似 ， 這種載體在 受體細胞有絲分裂時顯示出不穩(wěn)定性 。 成功表達。 目前對乙型肝炎病毒 還沒有一種有效的治療藥物 ， 因此高純度乙型疫苗的生產對預防病毒 感染具有重大的社會效益 ， 而利用重組酵母大規(guī)模生產乙型疫苗為其 廣泛應用提供了可靠的保證。 病毒顆粒的主要結構 蛋白是病毒的 表面抗原多肽 （ HBsAg） 或 S多肽 ， 它具有糖基化和非糖 基化兩種形式 。 nm的空殼亞病毒顆粒 ， 其免疫原性是未裝配的各種包裝蛋白組份的 1000倍。 乙型肝炎病毒的結構與性質 乙型肝炎病毒的包裝蛋白編碼基因 ATG ATG ATG TAA 108 aa 55 aa 226 aa preS1 preS2 S S 多肽 226 aa M 多肽 281 aa L 多肽 399 aa 乙型肝炎病毒的結構與性質 乙肝病毒在體外細胞培養(yǎng)基中并不能繁殖，因此第一代的乙肝疫 傳統(tǒng)乙肝疫苗的制備 苗是從病毒攜帶者的肝細胞質膜上提取出來的。 產乙肝表面抗原的重組釀酒酵母 20世紀 80年代開始選擇 釀酒酵母 表達重組 HBsAg， 主要工作包括 將 S多肽的編碼置于 ADH1啟動子控制下 ， 轉化子能表達出具有免疫活 性的重組蛋白 ， 它在細胞提取物中以球形脂蛋白顆粒的形式存在 ， 平 均顆粒直徑為 22nm， 其結構和形態(tài)均與慢性乙肝病毒攜帶者血清中 的病毒顆粒相同。 進一步的研究表明 ， M多肽和 L多肽對 S型疫苗具有顯著的增效作 用 ， 由三者 （ 或兩者 ） 構成的復合型乙肝疫苗還可以誘導那些對 S抗 原缺乏響應的人群的免疫反應。 重組菌首先在含有甘油的培養(yǎng)基中培養(yǎng) ， 待甘油耗盡后 ， 加入甲 醇誘導 HBsAg表達 ， 最終 S蛋白的產量可達細胞可溶性蛋白總量的 3% 在大規(guī)模的生產過程中 ， 巴斯德畢赤酵母工程菌在一個 240L的發(fā)酵罐 中培養(yǎng) ， 最終可獲得 90克 22nm的 HBsAg顆粒 ， 足夠制成 900萬份乙肝 疫苗。 由于不少藥用糖蛋白需要唾液酸化 ，因此其生產目前只能依靠哺乳動物宿主 ， 因為后者能進行人樣化的 N糖基化 反應