sds-page檢測重組蛋白-在線瀏覽
2024-08-17 12:04本頁面
【正文】 沖體系中的分離。與超速離心、凝膠過濾相比，SDSPAGE不需要昂貴的儀器設(shè)備，操作簡便，能在幾個小時內(nèi)得到結(jié)果，有較高的重復(fù)性，且不需要非常純的樣品，是目前為大家所接受的用于測定亞基的分子量的一種最好的方法。SDS是一種陰離子去污劑，作為變性劑和助溶劑，能斷裂分子內(nèi)和分子間的氫鍵，使分子去折疊，破壞蛋白質(zhì)分子的二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)。在樣品和凝膠中加入SDS和還原劑后，在100℃加熱3~5分鐘，分子被解聚為組成它們的多肽鏈。因此，結(jié)合了SDS的蛋白質(zhì)可以在聚丙烯酰胺凝膠中向正極泳動，同時由于聚丙烯酰胺凝膠的分子篩效應(yīng)，蛋白質(zhì)在凝膠中的遷移率主要決定于自身分子量的大小，即分子量小的蛋白質(zhì)分子通過凝膠孔的阻力小，遷移快，而分子量大的蛋白質(zhì)分子通過凝膠孔的阻力大，遷移慢。不連續(xù)系統(tǒng)對樣品具有濃縮效應(yīng)，從而提高了分離效果。濃縮膠的孔徑大，分離膠孔徑小，在電場的作用下，蛋白質(zhì)顆粒在大孔膠中泳動時遇到的阻力小，移動快，而在小孔膠中移動慢。（2）緩沖液離子成分及pH的不連續(xù)。Tris的作用是維持溶液的電中性及pH值，是緩沖配對離子，HCl在任何pH值溶液中均易解離出Cl（氯離子），它在電場中遷移率大，走在最前面，故稱為快離子或前導(dǎo)離子。蛋白質(zhì)SDS復(fù)合物帶有負電荷，向正極泳動，遷移率介于快慢離子之間，于是蛋白質(zhì)就在快慢離子間形成的界面處，被濃縮成極窄的區(qū)帶。蛋白質(zhì)由于分子量大，被留在后面，然后分成多個區(qū)帶，因此濃縮膠與分離膠之間pH值的不連續(xù)性，能控制遷移率：在濃縮膠中，要求慢離子較所有被分離樣品的有效遷移率低，以使樣品在快慢界面之間被濃縮；進入分離膠后，慢離子的有效遷移率比所有樣品的有效遷移率高，使樣品不再受離子界面的影響。電位梯度的高低與電泳速度的快慢有關(guān)（V=mE）。當三者的遷移率與電位梯度的乘積彼此相等時，三者的泳動速度就相等。蛋白質(zhì)（亞基）分子量的測定蛋白質(zhì)SDS膠束在水溶液中的形態(tài)，就像一個長橢圓棒，橢圓棒的短軸對不同的蛋白質(zhì)亞基SDS膠束而言，基本上都是相同的， nm。因此這種膠束在進行SDSPAGE時，電泳遷移率不再受到蛋白質(zhì)原有電荷的影響，而主要取決于橢圓棒的長軸長度，即取決于蛋白質(zhì)或亞基分子量的大小。由此可見，SDSPAGE不僅可以分離蛋白質(zhì)，而且可以根據(jù)遷移率大小測定蛋白質(zhì)亞基的分子量?，F(xiàn)在市售的蛋白質(zhì)Marker大多是由一系列純化的、具有不同分子量的蛋白質(zhì)組成的，它們之間不會發(fā)生相互作用，在進行SDSPAGE時具有良好的線性關(guān)系。在電泳時，將蛋白質(zhì)Marker點入與樣品相鄰的泳道，其各蛋白質(zhì)組分將在電泳過程中相互分離。為了在電泳時即時觀察蛋白質(zhì)的分離情況，還可以采用已經(jīng)經(jīng)過著色的蛋白質(zhì)Marker，通常稱為“彩虹”蛋白質(zhì)Marker。蛋白質(zhì)的遷移距離，即從分離膠的上沿至蛋白帶的中央的距離，可以用直尺直接測得，而蛋白質(zhì)的相對遷移率Rf是用每個蛋白帶的遷移距
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