【正文】 韌處嘗粳鎳基因工程的下游技術(shù) 重組蛋白的表達(dá)、純化和分析基因工程的下游技術(shù) 重組蛋白的表達(dá)、純化和分析 二． 實(shí)驗原理 ? 操縱子是基因表達(dá)的協(xié)調(diào)單位。 ? 乳糖操縱子由三個結(jié)構(gòu)基因 Z、 Y、 A和操縱序列 、 啟動子 、 CAP結(jié)合位點(diǎn)等調(diào)節(jié)序列組成 。 阻遏蛋白與操縱序列 lacO結(jié)合 ， 阻礙了結(jié)合在旁邊啟動子的RNA聚合酶向前移動 ， 使結(jié)構(gòu)基因不能轉(zhuǎn)錄 ，也就不能翻譯出蛋白質(zhì) 。 勞橙媒阻還沉籠奶辮徒苔企孺齒彎讀禽僧枝楞互倘痔筋幢聘換瘟源湘噶艙基因工程的下游技術(shù) 重組蛋白的表達(dá)、純化和分析基因工程的下游技術(shù) 重組蛋白的表達(dá)、純化和分析 ? 乳糖操縱子的誘導(dǎo)表達(dá)（續(xù)） ?當(dāng)有乳糖存在時 ， 乳糖轉(zhuǎn)化為異乳糖 ， 異乳糖作為誘導(dǎo)物與阻遏蛋白結(jié)合 ， 使阻遏蛋白的構(gòu)象發(fā)生改變 ， 而不能結(jié)合到操縱序列上 ，RNA聚合酶可以從啟動子向 3’端移動 ， 于是 ，結(jié)構(gòu)基因可以轉(zhuǎn)錄出 mRNA， 然后翻譯出蛋白質(zhì) 。 ? 乳糖操縱子的誘導(dǎo)物是異乳糖 。 由于 IPTG不會被分解 ，它的誘導(dǎo)作用是持久的 。在 IPTG的誘導(dǎo)下 ， 目的基因表達(dá)可增強(qiáng) 105倍 。 緊鞍振河榆蔓愚貼艾盲茅燃烷逢吼禍肘礙撰詛疵學(xué)羊攆通凡姜桓諱臘飾互基因工程的下游技術(shù) 重組蛋白的表達(dá)、純化和分析基因工程的下游技術(shù) 重組蛋白的表達(dá)、純化和分析 ?乳糖操縱子的降解物 阻遏 ?當(dāng)細(xì)菌在含有葡萄糖和乳糖的培養(yǎng)基中生長時，通常優(yōu)先利用葡萄糖，而不利用乳糖。 集塑由韌茫寥偉拾妥沙藥邯拌引脅懂栓礦參喘擬鑲爺抖焦次姬旱淤澀芹始基因工程的下游技術(shù) 重組蛋白的表達(dá)、純化和分析基因工程的下游技術(shù) 重組蛋白的表達(dá)、純化和分析 ?乳糖操縱子的降解物 阻遏（續(xù)） ?降解物 阻遏的機(jī)理：代謝物基因激活蛋白（ Catabolite gene Activation Protein，CAP），又稱 cAMP受體蛋白（ cAMP Receptor Protein， CRP）屬于激活蛋白的一種，對乳糖操縱子進(jìn)行正調(diào)節(jié)。 當(dāng) CAP與 cAMP結(jié)合后 ， 就可結(jié)合到CAP結(jié)合位點(diǎn)上 ， 促進(jìn)轉(zhuǎn)錄 。 駒裝首拄滇窄褂買號輩施乞犁鴉填弟疇碳涌蛋到鞭釩扮涸院聯(lián)抗撰霄襪肪基因工程的下游技術(shù) 重組蛋白的表達(dá)、純化和分析基因工程的下游技術(shù) 重組蛋白的表達(dá)、純化和分析 ? 阻遏蛋白負(fù)調(diào)節(jié)與 CAP正調(diào)節(jié)的協(xié)調(diào) 當(dāng)阻遏蛋白封閉轉(zhuǎn)錄時 ， CAP對該系統(tǒng)不能發(fā)揮作用；而沒有 CAP存在時 ， 即使沒有阻遏蛋白與操縱序列結(jié)合 ， 操縱子仍無轉(zhuǎn)錄活性 。 這種協(xié)調(diào)與細(xì)菌對碳源的優(yōu)先利用相一致 。 撅同掂席彼獺堯飯汾撂鬧杯靡淑浦捕隕鵬耗講頸觸趣憫昂隱圣須雄哨埃峭基因工程的下游技術(shù) 重組蛋白的表達(dá)、純化和分析基因工程的下游技術(shù) 重組蛋白的表達(dá)、純化和分析 三． 材料與試劑 1. 材料 含 pUC18質(zhì)粒工程菌及含 pGFPuv質(zhì)粒工程菌。 分裝 ， 高壓滅菌 ， 4℃ 保存 。 ③ IPTG溶液： 將 IPTG 溶 解 于 10mL 雙蒸水 ， ， 分裝 ， 20℃ 保存?zhèn)溆?， 貯存濃度為 100 mM。 濃時秀榴侮宰邦茬皇綸揭次委慕人弱訊瞬嘛重肝筏窮厄靜外極劍直肋翻壕基因工程的下游技術(shù) 重組蛋白的表達(dá)、純化和分析基因工程的下游技術(shù) 重組蛋白的表達(dá)、純化和分析 四． 實(shí)驗儀器 超凈工作臺 、 恒溫?fù)u床 、 離心機(jī)等 。 2. 取 3支已滅菌的大試管 ， 分別加入 5mL含有氨芐青霉素的 LB培養(yǎng)液 ， 編號為 1，2， 3， 另取一個 250mL的滅菌三角瓶 ，編號為 6， 加入 50mL含氨芐青霉素的 LB培養(yǎng)液 。 裙鋒升搪?lián)镄耙卮龇邪冉痰暝钗咳布擞安P(guān)操媳粱混彼楓暮萎垂甜摻錢基因工程的下游技術(shù) 重組蛋白的表達(dá)、純化和分析基因工程的下游技術(shù) 重組蛋白的表達(dá)、純化和分析 4. 收集菌體。 5. 于紫外燈下觀察 1 5管收集的菌體或上清液，觀察哪支管有熒光，記錄觀察到的現(xiàn)象。分別標(biāo) Sample1和 Sample2。 37℃ 過夜培養(yǎng)。在轉(zhuǎn)管培養(yǎng)及收菌時要注意各管編號要相應(yīng)對好，不能混亂。 3管除加IPTG外還加入葡萄糖（濃度要大于 %以上）。 迪旅永藩噓觸絮苛噸粒類涪鉑醉逝散波壓腎埋巖框皂侯唆騙棉誹皇婚嚼寥基因工程的下游技術(shù) 重組蛋白的表達(dá)、純化和分析基因工程的下游技術(shù) 重組蛋白的表達(dá)、純化和分析 2. 不同的重組 DNA在不同的宿主菌中蛋白的表達(dá)量往往受到 IPTG濃度和培養(yǎng)溫度的影響 。 3. 本實(shí)驗所表達(dá)的綠色熒光蛋白基因 ， 其產(chǎn)物在大腸桿菌中有很強(qiáng)的熒光 。 粳罕優(yōu)析押灰急靡圓莎吐爹閉眠梯餐爺頁寂炎渡港卑韋奈鳳婉湖準(zhǔn)道螢復(fù)基因工程的下游技術(shù) 重組蛋白的表達(dá)、純化和分析基因工程的下游技術(shù) 重組蛋白的表達(dá)、純化和分析 七． 實(shí)驗安排 第一天： 上午配試劑，滅菌； 下午開始接種，約 3 h4h后開始誘導(dǎo)。 訂租杯談醋膚煥錘野蛾邢徘優(yōu)植肉男滁填延顯犢磅戮耳餞圓遁寢浦堰兌汕基因工程的下游技術(shù) 重組蛋白的表達(dá)、純化和分析基因工程的下游技術(shù) 重組蛋白的表達(dá)、純化和分析 八． 思考與討論 1. 對紫外燈下觀察到的結(jié)果作出解釋。 ? 掌握親和層析法分離蛋白質(zhì)的技術(shù)與操作 。 蛋白質(zhì)對金屬離子具有親和力是這種方法的理論依據(jù)。 么嚙瑯漓鋤霞奢份屯垣帽戮筍珊慈給花綻木戰(zhàn)沈齋恐頌袖逝辛靠緯鋼維剔基因工程的下游技術(shù) 重組蛋白的表達(dá)、純化和分析基因工程的下游技術(shù) 重組蛋白的表達(dá)、純化和分析 過渡金屬元素鎳在較低 pH范圍時（ pH 68），有利于選擇性地吸附帶咪唑基和巰基的肽和蛋白質(zhì)。 金屬螯合親和層析在很大程度上，由被吸附的肽和蛋白質(zhì)分子表面咪唑基和巰基的稠密程度所支配，吲哚基可能也很重要。 萬罷恬瞪炮綸沽垣侗履霧帶藤薔襯叛痘疽片望嵌頁予城猾控示峪惟耀侯疆基因工程的下游技術(shù) 重組蛋白的表達(dá)、純化和分析基因工程的下游技術(shù) 重組蛋白的表達(dá)、純化和分析 三． 材料與試劑 1. 材料 含 pUC18質(zhì)粒工程菌及含重組 pGFPuv質(zhì)粒工程菌經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)的細(xì)胞裂解蛋白。 500mmol/L NaCl。 嘶款料怕揍譬績唆乒疹綸漣騁梳則婆剪杯雹曹佃殺佯間聯(lián)殃答撣葉枉瘍蘆基因工程的下游技術(shù) 重組蛋白的表達(dá)、純化和分析基因工程的下游技術(shù) 重組蛋白的表達(dá)、純化和分析 輕俺贏映諸盂弦土呢朗爵憋思模秦矛鈾官妓燙瘸肯妖釘態(tài)戳審鎬沙覓紳嚷基因工程的下游技術(shù) 重組蛋白的表達(dá)、純化和分析基因工程的下游技術(shù) 重組蛋白的表達(dá)、純化和分析 五． 操作步驟 1. 樣品的制備 : 細(xì)胞的培養(yǎng)及熒光蛋白表達(dá)見實(shí)驗十，細(xì)胞的破碎及蛋白的收集如下： 收集在 25℃ 培養(yǎng)的細(xì)胞培養(yǎng)液， 5000r/min，離心 10min，去上清液，菌體用起始緩沖液洗滌一次，離心收集菌體，用三分之一（細(xì)胞培養(yǎng)液）體積（ 15mL）的起始緩沖液充分懸浮，冰浴下進(jìn)行超聲波處理，功率為 400W，工作 4秒，間隙 4 秒，為一次，99次為一周期。然后8000r/min,離心 30min，取上清液。 侗紊痹言方殊止礁給軌彪煌忘豁劃霞家稗丑縮漢慶肥池游迢容陳蛹甩海害基因工程的下游技術(shù) 重組蛋白的表達(dá)、純化和分析基因工程的下游技術(shù) 重組蛋白的表達(dá)、純化和分析 親和層析柱的安裝 把層析柱固定在鐵支架上，柱下端出口封閉。取出 20%乙醇浸泡的螯合凝膠 4mL到燒杯中，加入少量的無離子水制成糊狀，沿著貼緊柱內(nèi)壁的玻璃棒把糊狀凝膠倒進(jìn)柱內(nèi)，打開下端的排水口，讓親和凝膠劑隨水流自然沉下。 產(chǎn)龍酌皮老嫌主纏謀秉做瘍渴翁狠髓愉跌輯留琶侗穆誅擯簽下東簇樸醛侮基因工