a重組蛋白分離純化方法選擇的基因原則-biotechn-在線(xiàn)瀏覽
2025-02-23 01:05本頁(yè)面
【正文】 常用的離子交換葡聚糖包括： 陽(yáng)離子交換劑 CMSephadex C25， CMSephadex C50 Sephadex C25， Sephadex C50 陰離子交換劑 DEAESephadex A25， DEAESephadex A50 QAESephadex A25， QAESephadex A50 離子交換介質(zhì)的基本性質(zhì) 常用的離子交換劑 離子交換瓊脂糖： 離子交換瓊脂糖 是攜帶 DEAE或 CM基團(tuán)的 Sepharose CL6B DEAESepharose（ 陰離子型 ）和 CMSepharose（ 陽(yáng)離子型） 尤其是介質(zhì)受 pH和離子強(qiáng)度的影響所引起的膨脹和收縮效應(yīng)較小，因 的離子交換介質(zhì)具有硬度大、性質(zhì)穩(wěn)定，流速好，分離能力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn) 此具有穩(wěn)定的外形體積 離子交換介質(zhì)的選擇原則 一般而言： 酸性 物質(zhì)用 陰離子 交換劑分離 氨基酸、核苷酸、蛋白質(zhì)等 兩性電解質(zhì) ，可根據(jù)其 pI值 及 離子化 堿性 物質(zhì)用 陽(yáng)離子 交換劑分離 曲線(xiàn) 來(lái)選擇 離子交換介質(zhì)的選擇原則 1 2 3 4 6 7 8 9 10 5 pH + 蛋 白 質(zhì) 凈 電 荷 等電點(diǎn) 吸附陰離子交換劑 吸附陽(yáng)離子交換劑 pH pI（ +） pH = pI（ 0） pH pI（ ） 對(duì) pI=5的某酸性蛋白質(zhì) 在 ， 當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)為陰離子時(shí)， 應(yīng)首選 DEAE纖維素 ； 在 ， 當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)為陽(yáng)離子時(shí)， 應(yīng)首選 CM纖維素 離子交換層析的基本操作 層析柱平衡 平衡緩沖液的用量至少為柱體積的 2 倍 平衡緩沖液的流速可略高于正常操作流速 平衡終點(diǎn)以流出液的離子濃度、導(dǎo)電性、 pH值與緩沖液一致 為準(zhǔn)，其中 pH值最重要 離子交換層析的基本操作 樣品進(jìn)柱 為了達(dá)到滿(mǎn)意的分離效果，進(jìn)樣量一般為介質(zhì) 交換容量 的 1020% 為了避免進(jìn)樣溶液中的離子強(qiáng)度過(guò)高，樣品濃度不宜太高 交換容量 ：離子交換劑中全部可交換的離子或功能基團(tuán)的總數(shù) 離子交換層析的基本操作 樣品洗脫 恒定洗脫 階段洗脫 梯度洗脫 10 20 30 40 50 60 70 80 90 分子濃度 離子強(qiáng)度 pH值 C 凝膠層析 10 外源基因表達(dá)產(chǎn)物的分離純化 凝膠層析的基本原理 凝膠介質(zhì)的基本性質(zhì) 凝膠層析的基本操作 凝膠介質(zhì)的選用原則 凝膠層析的基本原理 凝膠層析是利用有一定孔徑范圍的 多孔凝膠 作為固定相，對(duì)混合 物中各組份按分子大小進(jìn)行分離的層析技術(shù)，又稱(chēng)為 分子篩 分子直徑比凝膠最大孔隙直徑大的，會(huì)被全部排阻在凝膠顆粒之 外，即 全排阻 ；兩種全排阻的分子即使大小不同，也不能分開(kāi)；它們 下行速度快 分子直徑比凝膠最小孔隙直徑小的，能進(jìn)入凝膠顆粒的全部孔隙 即使大小不同也不能分開(kāi)；它們的下行速度慢 鑒于上述原理，凝膠層析可用于重組蛋白溶液 脫鹽 、 分子量測(cè)定 以及 分離純化 。 瓊脂糖凝膠 當(dāng)溫度高于 50℃ 時(shí)瓊脂糖凝膠便融化，只能在較低的溫度下使用。 Sepharose CL是二溴丙醇交聯(lián)的瓊脂糖，其孔徑大小和分離范圍 與普通 瓊脂糖 一樣，但熱和化學(xué)穩(wěn)定性增加，能高溫消毒。 聚丙烯酰胺凝膠的商品名為 BioGel， 型號(hào)從 P2至 P300共 10種 聚丙烯酰胺 凝膠 （ 數(shù)字 X1000就相當(dāng)于該凝膠的排阻限度） 凝膠介質(zhì)的選用原則 將樣品中的大分子物質(zhì)與小分子物質(zhì)分開(kāi)，稱(chēng)為 組別分離 ，其分 離策略是 使高分子物質(zhì)完全 被排阻 ， 小分子物質(zhì)完全滲入凝膠內(nèi)。 分級(jí)分離一般選用 排阻限度略大于樣品中最高分子量物質(zhì)的凝膠 在層析過(guò)程中，樣品中各組份均能不同程度地深入到凝膠內(nèi)部，但由 分級(jí)分離 于深入凝膠空隙程度上的差異，最后得到分離。 非專(zhuān)一性洗脫 化的配基對(duì)相應(yīng)的生物大分子的親和力降低 基結(jié)合的生物大分子的構(gòu)象發(fā)生變化，降低其親和力，但使用較廣 非專(zhuān)一性洗脫劑的作用并不是使被吸附的生物大分子
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