a重組蛋白分離純化方法選擇的基因原則-biotechn-文庫(kù)吧資料
2025-01-26 01:05本頁(yè)面
【正文】 樣可能使生物分子變性 配基必須具有適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)基團(tuán)， 這種基團(tuán)不參與配基與生物 分子之間特異結(jié)合，但可用于 和載體相連，同時(shí)又不影響配 基與生物分子之間的親和力 親和層析配基的性質(zhì)與選擇 酸酐法 N取代羥基琥珀酰亞胺法 配基的偶聯(lián) 疊氮化作用 還原性烷基化合物（西夫堿）的形成 親和層析的基本操作 通常采用改變 pH、 離子強(qiáng)度、離子種類(lèi)或者溫度等使與固定配 泛的是改變?nèi)芤旱碾x子強(qiáng)度。 組別分離一般選用 Sephadex G25或 G50， 對(duì)于小肽和低分子量 的物質(zhì)（分子量范圍 10005000）的脫鹽可選用 Sephadex G G 組別分離 1 BioGel P2或 P4 凝膠介質(zhì)的選用原則 將樣品中一些分子量比較接近的物質(zhì)分開(kāi)，這種分離叫 分級(jí)分離 該策略是 使高分子物質(zhì)完全 被排阻 ， 小分子物質(zhì)完全滲入凝膠內(nèi)。 凝膠介質(zhì)的基本性質(zhì) 聚丙烯酰胺 凝膠 是一種以丙烯酰胺為單位由甲叉雙丙烯酰胺交聯(lián) 而成的人工合成凝膠，控制交聯(lián)劑的用量可制成各種型號(hào)的凝膠，交 聯(lián)劑越多，孔隙越小。 瓊脂糖凝膠是一種大孔凝膠，因而適合于分離分子量較大的生物大 分子物質(zhì)（如蛋白質(zhì)和 DNA）。 凝膠介質(zhì)的基本性質(zhì) 葡聚糖凝膠的種類(lèi)有 G G1 G2 G50、 G7 G100、 G 150、 G200， G50即表示每克 干凝膠的吸水量為 葡聚糖凝膠 對(duì)堿比較穩(wěn)定 ，在酸性環(huán)境中其糖苷鍵易水解 濕態(tài)的葡聚糖可加熱到 110℃ ，干的則能耐受 120℃ 高溫 葡聚糖凝膠（ Sephadex ） Sephadex LH是羥丙基化的 Sephadex， 這類(lèi)層析介質(zhì)的流動(dòng)相既 可使用緩沖水溶液，也可使用極性有機(jī)溶劑，因此 適用于非水溶性溶 質(zhì)的凝膠過(guò)濾 凝膠介質(zhì)的基本性質(zhì) 瓊脂糖凝膠 是由瓊脂中分離出來(lái)的天然凝膠，常見(jiàn)的有 Sepharose （ Sepharose 2B、 4B、 6B， 數(shù)字代表干膠的百分比 ）和 BioGelA等 （ BioGelA 、 、 5M、 15M、 50M、 150M， 數(shù)字 X106代表排 阻限度。 B 離子交換層析 10 外源基因表達(dá)產(chǎn)物的分離純化 離子交換層析的基本原理 離子交換介質(zhì)的基本性質(zhì) 離子交換層析的基本操作 離子交換介質(zhì)的選擇原則 離子交換層析的基本原理 離子交換層析是以 離子交換劑 為 固定相 ，以特定的 含離子溶液 為 流動(dòng)相 ，利用離子交換劑對(duì)待分離的各種離子結(jié)合力的差異，而將混 合物中不同離子進(jìn)行分離的層析技術(shù)。 多種分離純化技術(shù)的聯(lián)合運(yùn)用 在進(jìn)行重組蛋白的純化時(shí)，通常需要綜合使用多種技術(shù)，一般來(lái) 說(shuō)，在選擇分離純化方法時(shí)應(yīng)遵循下列原則： 應(yīng)選擇不同分離純化機(jī)理的方法聯(lián)合使用 應(yīng)首先選擇能除去含量最多雜質(zhì)的方法 應(yīng)盡量選擇高效的分離方法 應(yīng)將最費(fèi)時(shí)、成本最高的分離純化方法安排在最后階段 合適分離純化介質(zhì)的選擇 常用的蛋白質(zhì)分離純化介質(zhì)有 Sephadex和 Seperose。A 重組蛋白分離純化方法選擇的基因原則 外源基因表達(dá)產(chǎn)物的分離純化 針對(duì)不同的產(chǎn)物表達(dá)形式采取不同的策略 針對(duì)不同性質(zhì)的重組蛋白選擇不同的層析類(lèi)型 多種分離純化技術(shù)的聯(lián)合運(yùn)用 合適分離純化介質(zhì)的選擇 分離純化過(guò)程的規(guī)?；? 針對(duì)不同的產(chǎn)物表達(dá)形式采取不同的策略 采用 分泌型戰(zhàn)略 表達(dá)重組蛋白，通常體積大、濃度低，因此應(yīng)在 純化之前采用沉淀或超濾等方法先進(jìn)行濃縮處理； 采用 包涵體型戰(zhàn)略 表達(dá)重組蛋白，應(yīng)先離心回收包涵體； 采用 融合型戰(zhàn)略 表達(dá)重組蛋白，一般是胞內(nèi)可溶性的，擬首先選 用親和層析進(jìn)行純化 表達(dá)在細(xì)胞膜和細(xì)胞壁之間的間隙中 的蛋白質(zhì)，應(yīng)用低濃度的溶 菌酶處理，然后再用滲透壓休克法釋放重組蛋白。 針對(duì)不同性質(zhì)的重組蛋白選擇不同的層析類(lèi)型 等電點(diǎn) 處于極端區(qū)域（ pI≤5 或 pI≥8 ）的重組蛋白應(yīng)首選離子 交換法進(jìn)行分離，這樣很容易除去幾乎所有的雜蛋白； 重組蛋白特異性的 配體
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