【正文】 球形羥基磷灰石克服了以上缺點，對于其它方法不易分離的蛋白質，可以用羥基磷灰石層析進行分離純化。疏水層析的選擇性依賴于疏水配體的結構，有烷基配體和芳香基配體，烷基的鏈越長，蛋白質的保留就越強。離子交換層析基于蛋白質與離子交換介質電荷間的相互作用，高于蛋白質等電點，蛋白質帶負電荷，低于蛋白質等電點蛋白質帶正電荷，不同的蛋白質在一定的pH條件下與介質上的離子之間相互作用不同，而產(chǎn)生不同的選擇性，根據(jù)帶電基團的類型和強度可分為四種類型：強陰離子交換層析、弱陰離子交換層析、強陽離子交換層析、弱陽離子交換層析，通常采用一定的平衡條件使目標蛋白選擇性的吸附在介質上，也可以使雜蛋白吸附，而目標蛋白選擇性的穿過。在重組蛋白的分離純化中，各種分離模式都得到應用。層析技術的第三個發(fā)展方向是操作模式的多樣化，已發(fā)展的操作模式有擴張床吸附、模擬移動床層析、置換層析、灌流層析和徑向層析，這幾種方法能夠具有處理大體積樣品的能力，適合于大規(guī)模生產(chǎn)應用。在過去的幾十年里各種層析用基質得到發(fā)展，如Sephacryl、Sepharose FF、 Sepharose HP、Superose、Superdex、SOURCE、Mono Beads、Toyopearl，這些基質都有其的物理和化學特點，在蛋白質的分離純化中發(fā)揮著重要的作用。在層析技術的發(fā)展過程中，首先是基質填料的發(fā)展。 層析技術在分離純化中的應用膜分離技術和沉淀分離技術是兩種傳統(tǒng)的技術，不管在實驗室研究，還是在工業(yè)的生產(chǎn)上都有應用，近年來功能性膜的應用和膜色譜的發(fā)展大大擴展了膜分離的應用領域，而親和技術和沉淀分離相結合產(chǎn)生了親和沉淀技術，提高了分離的特異性。表面活性劑Triton X114的臨界溶液濃度（critical solution temperature）為23℃，在此溫度以下，形成均一的溶液，在此溫度以上，則形成富含表面活性劑的相和低濃度表面活性劑的相，通過溫度誘導的相分離可以使膜蛋白進入富含表面活性劑的相，實現(xiàn)表達膜蛋白的濃縮，是一種應用廣泛的表面活性劑。對于分泌到周質間隙的蛋白質，使用滲透壓沖擊，凍融法，溶菌酶處理方法可以使目標蛋白釋放。大部分的可溶性重組蛋白在細胞質中表達，而一些膜蛋白常常表達于細胞內(nèi)膜上，還有一些則分泌到細菌的周質間隙或細胞外。重組蛋白在大腸桿菌中得到表達以后，首先必須從細菌釋放才能進行下游的分離純化過程。 其它的復性方法在單鏈Fv段的透析復性中，加入固定化的氧化還原酶DsbA和DsbC可以顯著提高折疊的效率，得到的單鏈Fv段和天然Fv段具有相同的功能（46）。分子伴侶和折疊酶在體外有兩個方面的應用，其一是在溶液中加入伴侶分子和/或折疊酶促進包涵體蛋白質的折疊和裝配（39），另一方面就是通過固定化的伴侶分子和/或折疊酶來介導蛋白質的折疊復性。C. 由固定化伴侶分子和/或折疊酶介導的色譜復性酮戊二酸載體蛋白是線粒體內(nèi)膜上的一種轉運蛋白， C41（DE3）作為宿主菌使C端帶有組氨酸標簽的目標蛋白形成包涵體獲得大量表達，再用鎳柱親和色譜進行復性和純化，獲得的融合蛋白具有和天然蛋白一樣的轉運活性，每升的細菌培養(yǎng)液可獲得15mg的活性蛋白（50）。Zahn等在鎳親和層析柱（NiNTA argrose）上通過鹽酸胍/谷胱甘肽梯度進行帶有組氨酸標簽的人朊病毒蛋白多肽片段的氧化再折疊，抑制了蛋白質聚集和分子間二硫鍵的形成，再用咪唑緩沖液對目標蛋白進行洗脫，純化的流程圖如圖4所示(20)。多肽通過在N端或C端加上一個親和標簽，在包涵體的純化上有兩個方面的用途，其一是包涵體變性溶解后，利用親和色譜直接進行包涵體溶液的純化，再用稀釋或透析的方法進行復性(55,57,60,64,65,68)，其二就是用于親和色譜復性(61,66,67,69,70)。在變性條件下，蛋白質能否進行離子交換色譜復性和疏水色譜復性，與蛋白質的理化性質密切相關，僅有有限的報道（36），而給蛋白質加上一個親和標簽，表達得到的包涵體再用親和色譜復性對不同的蛋白質有一定的通用性，應用也更為廣泛，尤其是金屬螯合親和色譜復性。吸附型色譜復性是在變性條件下，利用變性蛋白質可瞬間結合在特定層析介質上的特性，進行緩沖液的交換，降低變性劑的濃度，可先改變變性劑濃度使吸附的蛋白質逐漸的折疊復性，在柱中的變性劑溶液完全被置換成折疊緩沖液后，再通過在折疊緩沖液中加入鹽或其它添加劑進行原位純化洗脫，為了獲得好的折疊效率和純化效率，常采用梯度洗脫或階段洗脫的方法。對單鏈Fv片段包涵體蛋白，使用梯度同時改變變性劑濃度和pH，比單改變變性劑濃度的梯度復性或不使用梯度的凝膠過濾復性具有更高的活性得率（28）。這一復性過程中，梯度在上樣前就在層析柱中已經(jīng)形成，上樣后使用變性緩沖液進行洗脫，由于蛋白質受到的分子排阻比變性劑大，蛋白質移動的速度比變性劑梯度移動的速度快，最終蛋白質通過整個變性劑區(qū)，離開層析柱時處于折疊緩沖液中。在凝膠過濾復性中，發(fā)展了一種梯度復性的方法，這一方法的原理基于復性過程中，變性條件的快速改變加速了部分折疊蛋白質的聚集，導致沉淀形成和非特異性的吸附，通過梯度洗脫逐步降低變性劑的濃度，使蛋白質處于一個梯度改變的變性劑條件下，控制蛋白質的折疊和聚集速度，使蛋白質在離開層析柱時，處于折疊緩沖液中，從而改善活性蛋白的回收率。ller等用雙順反子表達載體同時表達等摩爾的A鏈和B鏈，但以包涵體的形式存在，為了得到活性的異源二聚體PDGFAB，包涵體用鹽酸胍變性后，先在變性條件下用凝膠過濾層析進行純化，使用稀釋復性，蛋白質嚴重聚集，即使在10μg/ml蛋白質濃度條件下，也只能得到45%可溶性蛋白，而用凝膠過濾復性，同時洗脫的A亞基和B亞基可以緩慢二聚化產(chǎn)生異源二聚體，,最終異源二聚體得率可達75%（26）。凝膠過濾復性時，變性蛋白質加樣于折疊緩沖液平衡好的凝膠過濾柱上，然后用折疊緩沖液進行洗脫，凝膠過濾層析有不同的分子量分級范圍，有助于聚集蛋白質和正確折疊蛋白質的分離。在折疊中，吸附的位點會影響到折疊，所以要優(yōu)化折疊的條件，才能得到好的折疊效果。復性折疊中存在的一個問題就是蛋白質的聚集，為了減少導致蛋白質聚集的分子間相互作用，可將蛋白質結合在分離介質上，達到溶液中變性劑濃度的稀釋和蛋白質的折疊，這一類型的復性為吸附型色譜復性，包括親和色譜復性，疏水相互作用色譜復性，離子交換色譜復性。色譜復性的方法的優(yōu)點是可以顯著的減少處理的時間，減少變復性過程中分子的聚集，使復性的同時也達到了純化的效果。 色譜復性溶解復性獲得的蛋白質，需要通過離心和過濾的方法去除不溶性的物質，再按可溶性蛋白質的處理方法進行下游的分離純化。另一種策略是將變性蛋白分成幾份按一定的時間間隔逐步加入折疊緩沖液中，可以減少處理的體積、改善折疊的效率（35）。這個研究小組用相同的方法進行白介素12包涵體的折疊復性，僅加入氧化型谷胱甘肽而沒有還原型谷胱甘肽只有約57%的折疊效率，當兩者同時加入后則可達到90%（42），這些結果表明前一種蛋白比較容易形成正確的二硫鍵，而白介素12折疊復性需要加入還原型的谷胱甘肽促進二硫鍵重組，使蛋白質最終選擇天然的二硫鍵，并促進折疊。在胰凝乳蛋白酶原的折疊復性中， M或高于3 M都會造成大量的沉淀， M濃度時有一半的蛋白質沒有正確折疊，而在1 M時則完全折疊，說明折疊時的變性劑并不是越低越好，而是存在一個最佳濃度（13）。除了要考慮降低變性劑的濃度，還要考慮每一階段的氧化還原狀態(tài)，以及溫度、添加劑等因素。透析的方法不顯著的改變?nèi)芤旱捏w積，但時間較長，而且易形成蛋白質沉淀，所以透析起始的蛋白質濃度非常關鍵，而且僅對一些蛋白質有效。對于折疊，是一個一級的反應過程，而聚集是一個高級的反應過程，依賴蛋白質的濃度，所以需要小心的選擇蛋白質的濃度，一般的蛋白質的終濃度保持在2050μg/mL。為了很快避開低溶解性變性劑區(qū)（如圖2中c區(qū)段所示），減少蛋白的聚集，在進行稀釋時一定要快速。 稀釋復性和透析復性此外，在前胰島素的折疊復性中也應用了磺酸化保護（44,47,48），所以這一方法在進行復雜蛋白的變復性時可以采用。人組織纖溶酶原激活劑（tPA）含有35個半胱氨酸殘基，可形成17對二硫鍵，即使在天然狀態(tài)下也只具有低的溶解性，進行原核表達時這兩種巰基保護方法都被用于該蛋白質的折疊復性，由于在蛋白質的巰基上引入了帶電荷的殘基，增加了變性蛋白和部分折疊的溶解性，減少了復性過程中蛋白質的聚集，可獲得較高的復性效率（25,32,33）。常用的方法有：1 使用金屬催化的空氣氧化，并添加還原劑促進二硫鍵改組，由于氧在蛋白質溶液中溶解性低，這種方法的效率較低，改用攪拌促進氧的質量傳輸，又會造成蛋白質的聚集；2 使用小分子還原型和氧化型的巰基對，包括還原型和氧化型的谷胱甘肽（GSH/GSSG）、半胱氨酸和胱氨酸（cysteine/cystine）、半胱胺和胱胺（cysteamine/cystamine）、二硫蘇糖醇和氧化型谷胱甘肽（DTT/GSSG），二流赤蘚糖醇和氧化型谷胱甘肽（DTE/GSSG），這一方法是目前常用的方法，通常使用的巰基總濃度為515mM，還原劑和氧化劑的比為5:1―1:1（4,74）。配體，穩(wěn)定天然結構狀態(tài)低濃度鹽酸胍，使部分折疊的不穩(wěn)定/增加天然構象蛋白質的溶解性N氧化三甲胺（TMAO），對蛋白質具有優(yōu)先的水合作用/滲壓劑硫代甜菜堿類物質（NDSBs），保護非極性表面兩性離子表面活性劑（Zwitterionic detergents），保護非極性表面乙醇，調(diào)節(jié)極性阿拉伯聚糖，增加黏度L精氨酸，兩親分子/滲壓劑增加蛋白質折疊的添加劑另一種方法就是加入添加劑來減少聚集，促進折疊，如L精氨酸，鹽，有機溶劑，一些表面活性劑，滲透壓調(diào)節(jié)劑（osmolytes），硫代甜菜堿類物質（NDSBs），這些物質或穩(wěn)定蛋白質的天然構象，或使部分折疊的不穩(wěn)定，表2 列出了這些化合物和它們可能的作用機制，它們在蛋白質的折疊中起著重要的作用，已得到廣泛的應用（13,25,32,4,74），但對于其中的好些化合物參與折疊的作用機制我們還了解不多。通常包涵體在變性溶解后具有高的純度，可以直接進行復性。蛋白質分子變性后，通過改變折疊的條件使蛋白質恢復其天然構象的過程，稱為復性。以上變性的方法屬于化學變性，使用高的靜力壓提供了蛋白質變性的另外一種物理變性方法，靜力壓促進蛋白質變性解離，是因為蛋白質在變性條件下，系統(tǒng)整體趨向于更小的體積。但采用的高pH條件可以使氨基酸殘基發(fā)生化學修飾，還需要更多的驗證（73）。對含有分子間二硫鍵或非天然二硫鍵的包涵體蛋白質，在溶解過程中需要加入還原劑，如二硫蘇糖醇，β巰基乙醇，還原型谷胱甘肽，加入螯和劑，如EDTA，可以防止金屬催化的半胱氨酸氧化。通常要選用強的變性劑使蛋白質完全變性溶解，如6 M的鹽酸胍和8 M 的尿素，蛋白質濃度多采用110mg/ml（22）。分離包涵體的第一步是對細菌進行最大限度的溶解，將幾種細胞破碎技術相結合，如聯(lián)合使用溶菌酶處理，高壓勻漿細胞破碎和含表面活性劑的高鹽溶液處理，可以使膜碎片和細胞壁碎片最大限度的分解。對于同一蛋白質，采用的滲透壓調(diào)節(jié)劑（osmolytes）不同，蛋白質折疊的途徑也不相同，說明不同的滲透壓調(diào)節(jié)劑對蛋白質的穩(wěn)定效應不同（11）。后來的研究表明折疊過程存在實驗可測的多種，折疊通過有限的路徑進行。盡管蛋白質的氨基酸序列在蛋白質的正確折疊中起著核心的作用，各種各樣的因素，包括信號序列，輔助因子，分子伴侶，環(huán)境條件，均會影響蛋白質的折疊，新生蛋白質折疊并組裝成有功能的蛋白質，并非都是自發(fā)的，在多數(shù)情況下是需要其它蛋白質的幫助，已經(jīng)鑒定了許多參與蛋白質折疊的折疊酶和分子伴侶（3,16,86），蛋白質“自發(fā)折疊”的經(jīng)典概念發(fā)生了轉變和更新，但這并不與折疊的熱力學假說相矛盾，而是在動力學上完善了熱力學觀點。早在上世紀30年代，我國生化界先驅吳憲教授就對蛋白質的變性作用進行了闡釋（8），30年后，Anfinsen通過對核糖核酸酶A的經(jīng)典研究表明去折疊的蛋白質在體外可以自發(fā)的進行再折疊，僅僅是序列本身已經(jīng)包括了蛋白質正確折疊的所有信息（9,10），并提出蛋白質折疊的熱力學假說，為此Anfinsen獲得1972年諾貝爾化學獎。 蛋白質折疊的過程和機理前兩個步驟效率較高，但是再折疊的效率率常常不能令人滿意，折疊的方法和折疊的條件需要通過實驗來進行篩選。這一圖示所展示的規(guī)律對所有蛋白并不是統(tǒng)一的，但它向我們描述了一個大概的情況，在這一過程，不僅僅要考慮變性劑對天然構象和折疊的穩(wěn)定作用，還要考慮對蛋白溶解性的影響。所以選擇b區(qū)段所在的變性劑濃度來進行蛋白質的折疊更為有效，這一區(qū)段即可以穩(wěn)定蛋白質的天然構象，而且可以增加天然構象蛋白質的溶解性，對于部分折疊的卻沒有穩(wěn)定作用。在高的變性劑濃度條件下，蛋白質的極性和非極性側鏈都是可溶的，但是蛋白質卻是去折疊的，如圖2中d所標的區(qū)段。通過對內(nèi)皮抑素折疊機制的研究表明，緊密折疊的內(nèi)皮抑素對酸耐受，在酸性條件下有可能得到大量的正確折疊的蛋白質（15）。內(nèi)皮抑素（endostatin）可以特異性的抑制內(nèi)皮細胞的增殖，具有抑制新生血管生成和抑制腫瘤生長的作用，已進入臨床研究階段。從另一方面來講形成的包涵體易于和細胞的其它成分分離，而且過量表達的目標蛋白在包涵體中得到了富集，提高了純度，降低了分離純化的難度。由于影響蛋白質細胞合成和折疊的因素太多，優(yōu)化結果不可預測，如對于Fab片段，盡管只有可變區(qū)序列不同，也不能預測新的Fab片段在體內(nèi)是否可以正確折疊（4），所以即使采用了促進可溶性表達的方法，也不能保證不形成包涵體。蛋白質進行可溶性表