【正文】 切位點，不影響目標蛋白的酶切；5 加上信號肽序列，可使融合蛋白進行大腸桿菌周質(zhì)表達，某些情況下，可進行胞外表達。為了使融合蛋白耐溴化氰和羥胺處理，對5個IgG結(jié)合結(jié)構(gòu)域中的B結(jié)構(gòu)域進行了結(jié)構(gòu)改造，替換了溴化氰和羥胺處理敏感的氨基酸，就有了Z標簽，越來越多的應(yīng)用更優(yōu)先選用Z標簽和它的雙體ZZ標簽。除了大腸桿菌以外，在其它的表達系統(tǒng)（、植物細胞、昆蟲細胞、CHO細胞）中已成功的表達了Protein A和ZZ融合蛋白。由于基于Protein A的親和標簽的親和性比較高，要在相對劇烈的條件下（低pH）進行洗脫，所以可能造成目標蛋白的失活，另一個問題就是IgG親和層析介質(zhì)較貴，并且不耐清洗處理。G252。lich等對Protein A進行了結(jié)構(gòu)改造，降低結(jié)合的強度，（102）。鏈球菌Protein G是存在于某些鏈球菌菌株表面的雙功能受體，可以同時結(jié)合IgG和白蛋白，并且這兩段功能區(qū)域在結(jié)構(gòu)上分離。白蛋白結(jié)合區(qū)域在大腸桿菌中表達高度可溶，性質(zhì)穩(wěn)定，不被蛋白酶降解，結(jié)合上信號肽能有效的分泌。這一區(qū)域的不同部分BB、ABP和ABD被用于一步人白蛋白親和層析純化（結(jié)合有種屬特異性，對人的白蛋白結(jié)合最強），并在多種表達系統(tǒng)中得到應(yīng)用?；赑rotein G的親和標簽最重要的用途在于傳輸?shù)鞍踪|(zhì)藥物，融合蛋白的白蛋白結(jié)合特性使得目標蛋白的血漿半衰期延長，增強了療效。BB融合標簽還可以刺激目的蛋白的抗體響應(yīng)，可用于免疫動物生產(chǎn)。4 能與抗生物素蛋白特異性結(jié)合的親和標簽 生物素抗生物素蛋白（AvidinBiotin）是目前所知的最強的親和作用之一，其解離常數(shù)Kd為1015M，然而太強的結(jié)合使得重組蛋白很難在相對溫和的條件下洗脫下來，所以需要在親和標簽/配體對的特異性和解離常數(shù)之間尋找一個平衡。體外也可對蛋白賴氨酸殘基進行生物素化標記，但不具有特異性，不能用于親和純化，研究者轉(zhuǎn)向?qū)ふ殷w內(nèi)可特異性生物素化的多肽，并把它用于親和融合策略。 很少有蛋白在體內(nèi)可以被生物素化修飾，乙酰輔酶A的生物素羧基載體蛋白（BCCP）是存在于大腸桿菌（E. coli）的唯一一個可生物素化蛋白，生物素在生物素連接酶（BirA）的催化下特異性的修飾其中的一個賴氨酸殘基，研究表明其C末段101個氨基酸的肽段已經(jīng)具有可被生物素化的功能，Promega的PinPoint載體就編碼這個標簽，使用其SoftLink親和素（即抗生物素蛋白）介質(zhì)可以在弱的條件下洗脫融合蛋白（5mM生物素溶液）。 Strep Tag 系統(tǒng)是通過篩選噬菌體隨機肽庫而得到的短肽（含9個氨基酸殘基），將其進行目標蛋白的C端融合可以模擬生物素和鏈霉抗生物素蛋白特異性相互作用，使用亞胺生物素洗脫。這一系統(tǒng)不能進行N端融合，而且變性劑會影響親和相互作用。后來發(fā)展的8氨基酸Strep tag Ⅱ標簽，與Strep Tag相似，本身并不能生物素化，但卻可以模擬生物素的功能和鏈霉抗生物素蛋白變體StrepTactin特異性的相互作用，可加在蛋白的N端和C端，使用便宜的脫硫生物素進行洗脫，而且Strep tag Ⅱ和StrepTactin相互作用不受變性劑的影響，可在變性條件下純化。 AviTag由篩選肽庫得到15 個氨基酸的短肽，具有一個單生物素化賴氨酸位點，與已知天然可生物素化一致序列完全不同，可以加在目標蛋白的N端和C端，融合表達后，可被生物素連接酶BirA（細菌具有內(nèi)源性的生物素連接酶，但為了使重組蛋白完全生物素化，感受態(tài)細菌已轉(zhuǎn)化高水平表達生物素連接酶的質(zhì)粒）生物素化，為了純化重組蛋白選用低親和性的單體抗生物素蛋白或抗生物素蛋白衍生物，除了用于蛋白質(zhì)分離純化，還用于蛋白質(zhì)相互作用研究。5 麥芽糖結(jié)合蛋白（MBP） 大腸桿菌麥芽糖結(jié)合蛋白是malE基因的產(chǎn)物，定位在細胞的周質(zhì)空間，可以特異性的結(jié)合麥芽糖或糊精麥芽糖復合物，協(xié)助這些物質(zhì)轉(zhuǎn)運到細胞內(nèi)。這一系統(tǒng)使用交聯(lián)直鏈淀粉的親和介質(zhì)純化，用麥芽糖進行競爭性洗脫，具有如下優(yōu)點：1 MBP不含有半胱氨酸殘基，不會干擾目標蛋白形成正確的二硫鍵；2 使用的介質(zhì)價格低廉；3 可以在溫和的條件下洗脫融合蛋白；4 加上其分泌信號，可以進行分泌表達在細胞周質(zhì)，由于周質(zhì)是偏氧化的環(huán)境，可以促進目標蛋白形成正確的二硫鍵；5 這一系統(tǒng)最顯著的特點是與麥芽糖結(jié)合蛋白（MBP）進行融合表達可以改善目標蛋白的溶解性，促進正確折疊，提高活性蛋白的回收率，實驗證明MBP比硫氧還蛋白和GST都要有效（103,106）。與硫氧還蛋白不同，MBP進行C端融合也可以促進蛋白的可溶性表達（107），擴展了MBP的應(yīng)用。一般認為MBP促進可溶性表達與它具有分子伴侶樣的特性有關(guān)，MBP可以直接的和折疊相互作用，抑制聚集的發(fā)生，從而使它區(qū)別于別的標簽（103,109,110）。6 鈣調(diào)蛋白結(jié)合肽（CBP） 鈣調(diào)蛋白結(jié)合肽（CBP）有26個氨基酸殘基，來源于骨骼肌肌球蛋白輕鏈激酶C末段，鈣調(diào)蛋白結(jié)合肽與鈣調(diào)素結(jié)合是Ca2+依賴的，這種結(jié)合不受標簽所處的位置影響（N端和C端均可），在中性pH條件下使用2mM EGTA可以很方便的將目標蛋白洗脫下來。這一系統(tǒng)有如下優(yōu)點：1 特異性很高，因為大腸桿菌沒有可以和鈣調(diào)素結(jié)合的蛋白；2 與His標簽相比可以在強還原性條件下純化。7 纖維素結(jié)合肽（CBD） 纖維素結(jié)合肽（CBD）融合蛋白能與纖維素介質(zhì)特異性的結(jié)合，可以在溫和的條件下洗脫（乙二醇或低鹽條件），pET CBD 載體含有纖維素結(jié)合肽（CBD）的序列，可方便構(gòu)建。8 幾丁質(zhì)結(jié)合肽 New England Biolabs 提供的IMPACT（InteinMediated Purification with an affinity Chitinbinding Tag）系統(tǒng)使用幾丁質(zhì)結(jié)合肽（來源于環(huán)狀芽胞桿菌）作為融合標簽，表達的融合蛋白可以用幾丁質(zhì)親和層析純化，利用內(nèi)含肽（intein）的特異性原位剪切直接獲得目標蛋白。這一系統(tǒng)包括以下幾類：1 巰基誘導的N端剪切系統(tǒng)（相對內(nèi)含肽來講），有pTYB1和其衍生載體，使用的內(nèi)含肽來源于釀酒（Saccharomyces cerevisiae）VMA1基因，將最后一個氨基酸進行了N454A突變，使內(nèi)含肽的C端不能被剪切，在巰基的誘導下，內(nèi)含肽的N端發(fā)生重排、裂解、水解，就得到目標蛋白，由于細菌表達，目標蛋白N端有甲硫氨酸，C端不引入額外的氨基酸殘基；2 巰基誘導的C端剪切系統(tǒng)，有pTYB11和pTYB12載體，同樣使用來源于釀酒VMA1基因的內(nèi)含肽，內(nèi)含肽C端的剪切依賴于其Ｎ端剪切位點的巰基誘導裂解，幾丁質(zhì)結(jié)合肽序列插入到內(nèi)含肽的核酸內(nèi)切酶結(jié)構(gòu)域，Ｎ端為半胱氨酸的蛋白不能使用這一系統(tǒng)剪切；３ pH誘導的C端剪切系統(tǒng)，有pTWIN 載體，內(nèi)含肽來源于一種藍細菌的dnaB基因，有429個氨基酸殘基，N端的半胱氨酸殘基被丙氨酸殘基取代，使內(nèi)含肽不具有N端的裂解活性，而保留C末端pH誘導剪切的特性，剪切能有效進行，pH，內(nèi)含肽的N端融合幾丁質(zhì)結(jié)合肽，C端融合目標序列，在pH ℃條件下剪切； 4可以用于蛋白質(zhì)環(huán)化的雙內(nèi)含肽系統(tǒng)，目的蛋白處于兩個內(nèi)含肽之間，先通過pH誘導目標蛋白N端內(nèi)含肽被剪切，再用巰基誘導C端內(nèi)含肽被剪切，剪切后產(chǎn)生N端為半胱氨酸殘基和C端為硫脂鍵的蛋白，通過自發(fā)的縮合可形成環(huán)化蛋白。與傳統(tǒng)的親和融合系統(tǒng)相比，這一系統(tǒng)的最大優(yōu)點在于不需要使用蛋白酶來去除融合標簽。9 FLAG表位標簽，T7表位標簽和S標簽 FLAG肽序列（DYKDDDDK）的親水性很強，片段小，并且具有腸激酶的酶切位點，一般不會影響目標蛋白的活性。FLAG標簽的最初用途是用于蛋白檢測，可以在飛摩爾水平特異性檢測目標蛋白，Sigma將3個FLAG表位（DYKD）串聯(lián)，中間以兩個氨基酸間隔，可以將蛋白分析靈敏度提高1020倍?？笷LAG的單M1和FLAG結(jié)合是Ca2+依賴的，加入螯和劑可以在溫和的條件下將融合蛋白洗脫，但M1 只能結(jié)合處在N端最外面的FLAG標簽，所以只可用于去除信號肽后的FLAG融合蛋白。篩選的M2可以和前面多一個甲硫氨酸的FLAG標簽或C端的FLAG標簽結(jié)合，但這種結(jié)合是Ca2+非依賴的，需要使用低pH洗脫，或用合成的FLAG肽進行競爭性洗脫。這一系統(tǒng)可在多種表達系統(tǒng)中使用，主要的缺點是M1和M2親和介質(zhì)特別昂貴。T7 標簽為T7 基因10蛋白的最前面11個氨基酸，通過免疫親和層析進行純化。S標簽為15 個氨基酸的多肽標簽，可以特異性的和S蛋白介質(zhì)結(jié)合。由于S標簽和S蛋白結(jié)合形成有活性的核糖核酸酶，可以靈敏的定量檢測融合蛋白。 親和標簽的比較和選擇 目前對于不同的親和表達純化系統(tǒng)的比較還不多，親和純化的選擇還是多根據(jù)經(jīng)驗來確定，最近Lichty等以純度、產(chǎn)率和花費為指標比較了幾種親和純化標簽的純化效果，認為金屬螯和親和層析容量高，價格便宜，從大腸桿菌提取物中純化組氨酸標簽（His tag）融合蛋白的得率高，純度中等，從、果蠅和Hela細胞的提取物中得到蛋白的純度就較低，對于鈣調(diào)蛋白結(jié)合肽（CBP）融合蛋白，從大腸桿菌、果蠅提取物中純化的純度中等，而從Hela細胞提取物中能得到很好的純度，基于表位的標簽FLAG和HPC（蛋白Ｃ重鏈）能從４種提取物中得到高純度的蛋白，但使用的介質(zhì)價格昂貴、吸附容量低，Strep tag Ⅱ標簽融合可以在中等花費的情況下得到相對較好的得率和純度（100），這方面的研究對于選擇不同的親和標簽提供了很好的實驗基礎(chǔ)。在10脫乙酰漿果赤霉素Ⅲ10氧乙酰轉(zhuǎn)移酶（10DABT）的表達純化中，F(xiàn)ang等比較了GST系統(tǒng)、6His系統(tǒng)和PinPoint系統(tǒng)對融合蛋白表達和純化的影響，6His融合蛋白在高濃度誘導物條件下的表達水平最高，但只有25% 的可溶性蛋白，一步純化只得20%的純度，GST融合蛋白表達水平低一些，可溶性蛋白卻占了約80%，親和層析后純度為40%，可生物素化標簽融合蛋白表達水平最低，可溶性蛋白只占40%，親和層析后純度60%，可見不同親和表達純化系統(tǒng)對上游、下游各個階段的影響不一樣，需要綜合平衡考慮（101）。當前許多生物的基因組測序已經(jīng)完成，結(jié)構(gòu)和蛋白質(zhì)組成為研究的主要領(lǐng)域，需要發(fā)展大規(guī)模和高通量的技術(shù)進行蛋白質(zhì)的表達、純化、活性和結(jié)構(gòu)分析。使用原核系統(tǒng)有許多優(yōu)點，如易于操作、生長快速、表達水平高，但在原核系統(tǒng)真核蛋白常常不能獲得可溶性表達，主要的原因有以下幾點：1 原核系統(tǒng)沒有真核的分子伴侶；2 原核系統(tǒng)不能進行糖基化等翻譯后修飾；3 不能進行亞細胞定位；4 沒有與其結(jié)合起穩(wěn)定作用的同伴分子。前面我們已經(jīng)介紹了多種促進蛋白質(zhì)可溶性表達的方法，但親和融合策略是適應(yīng)大規(guī)模原核可溶性表達最為行之有效的方法。Hammarstr246。m等比較了7 種標簽對32種人源蛋白原核表達和可溶性的影響，N端His標簽和GST融合蛋白的表達的比率為59%，Gb1（來源于protein G的Gb1 結(jié)構(gòu)域）、ZZ、NusA（抗轉(zhuǎn)錄終止因子）和MBP融合蛋白的表達比率在70%81%，硫氧還蛋白融合蛋白的表達比率達到89%，在表達的27個蛋白（分子量小于20Kda）中，對可溶性的影響順序如下：硫氧還蛋白~Gb1~MBPZZ~NusAGST6His，但其中沒有任何一個可以解決所有的可溶性表達問題，所以只有組合應(yīng)用不同的標簽，才能獲得高的可溶性表達比率（108）。通過對30個哺乳動物全長蛋白和結(jié)構(gòu)域的融合表達研究，Dyson等總結(jié)出了幾個與可溶性表達相關(guān)的蛋白質(zhì)特征，包括蛋白的分子量、毗鄰的疏水氨基酸個數(shù)、低復雜性區(qū)域，而與蛋白的等電點、疏水性平均值（GRAVY）和亞細胞定位無關(guān)。N端融合硫氧還蛋白和MBP可以最有效的促進蛋白的可溶性表達，C端的融合標簽中MBP最為有效。使用H10MBP融合（MBP前面加上10個組氨酸的標簽），95個蛋白中有63個蛋白可溶性表達的水平大于1mg/l，未成功表達的蛋白大多具有分子量高、毗鄰疏水氨基酸個數(shù)多和低復雜性區(qū)域多的特征，進一步驗證了前面的結(jié)論。所以作者建議如果蛋白具有如下特征：分子量小于30KDa，只含有1或很少數(shù)的低復雜性區(qū)域，毗鄰疏水氨基酸少于4個，通用的策略是進行N端硫氧還蛋白和MBP融合或C端MBP融合，對于大于50KDa的蛋白，有效的策略是將蛋白質(zhì)切割表達不同的結(jié)構(gòu)域（107）。1. 結(jié)語在下游處理過程中，高效的層析技術(shù)組成了蛋白質(zhì)分離純化的骨架，親和的策略在過去的幾十年里得到了快速的發(fā)展和廣泛的應(yīng)用，大大簡化了純化的流程，降低了純化的難度，充分體現(xiàn)了下游技術(shù)和上游策略的緊密結(jié)合。下游的純化工藝應(yīng)當立足于對純化蛋白質(zhì)的最終要求，如純度、穩(wěn)定性和用途。另外要考慮的就是原材料的性質(zhì)，包括來源于什么表達系統(tǒng)（如細菌、哺乳動物細胞），主要的雜蛋白（如宿主細胞蛋白、產(chǎn)品的不同變體），需要處理的固體（如細胞、膜碎片、包涵體），以及蛋白的性質(zhì)（如所帶電荷、滴定曲線、等電點、分子量、表面疏水性、特異的結(jié)合特性和熱穩(wěn)定性），這些信息都有助于每一步分離純化工藝的開發(fā)。從我們的論述中，可以看到要得到重組蛋白，可以通過多種途徑，有很多表達純化系統(tǒng)可供選擇，各種系統(tǒng)各有特點和優(yōu)缺點，這時就要綜合考慮。即使是設(shè)計好了表達純化系統(tǒng)，在實際的應(yīng)用中會遇到新的問題，如選用的表達系統(tǒng)表達水平很低，這種低的表達水平是否在純化上具有優(yōu)勢，GST融合蛋白可能不是可溶性表達而是包涵體，預先選用的酶切位點存在非特異性酶切，在所用的洗脫條件下蛋白質(zhì)不穩(wěn)定，這時就要要根據(jù)實際情況來解決問題。31 / 3