【正文】 即使是設(shè)計(jì)好了表達(dá)純化系統(tǒng)，在實(shí)際的應(yīng)用中會(huì)遇到新的問題，如選用的表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)水平很低，這種低的表達(dá)水平是否在純化上具有優(yōu)勢(shì)，GST融合蛋白可能不是可溶性表達(dá)而是包涵體，預(yù)先選用的酶切位點(diǎn)存在非特異性酶切，在所用的洗脫條件下蛋白質(zhì)不穩(wěn)定，這時(shí)就要要根據(jù)實(shí)際情況來解決問題。下游的純化工藝應(yīng)當(dāng)立足于對(duì)純化蛋白質(zhì)的最終要求，如純度、穩(wěn)定性和用途。 結(jié)語1.所以作者建議如果蛋白具有如下特征：分子量小于30KDa，只含有1或很少數(shù)的低復(fù)雜性區(qū)域，毗鄰疏水氨基酸少于4個(gè)，通用的策略是進(jìn)行N端硫氧還蛋白和MBP融合或C端MBP融合，對(duì)于大于50KDa的蛋白，有效的策略是將蛋白質(zhì)切割表達(dá)不同的結(jié)構(gòu)域（107）。N端融合硫氧還蛋白和MBP可以最有效的促進(jìn)蛋白的可溶性表達(dá)，C端的融合標(biāo)簽中MBP最為有效。m等比較了7 種標(biāo)簽對(duì)32種人源蛋白原核表達(dá)和可溶性的影響，N端His標(biāo)簽和GST融合蛋白的表達(dá)的比率為59%，Gb1（來源于protein G的Gb1 結(jié)構(gòu)域）、ZZ、NusA（抗轉(zhuǎn)錄終止因子）和MBP融合蛋白的表達(dá)比率在70%81%，硫氧還蛋白融合蛋白的表達(dá)比率達(dá)到89%，在表達(dá)的27個(gè)蛋白（分子量小于20Kda）中，對(duì)可溶性的影響順序如下：硫氧還蛋白~Gb1~MBPZZ~NusAGST6His，但其中沒有任何一個(gè)可以解決所有的可溶性表達(dá)問題，所以只有組合應(yīng)用不同的標(biāo)簽，才能獲得高的可溶性表達(dá)比率（108）。前面我們已經(jīng)介紹了多種促進(jìn)蛋白質(zhì)可溶性表達(dá)的方法，但親和融合策略是適應(yīng)大規(guī)模原核可溶性表達(dá)最為行之有效的方法。當(dāng)前許多生物的基因組測(cè)序已經(jīng)完成，結(jié)構(gòu)和蛋白質(zhì)組成為研究的主要領(lǐng)域，需要發(fā)展大規(guī)模和高通量的技術(shù)進(jìn)行蛋白質(zhì)的表達(dá)、純化、活性和結(jié)構(gòu)分析。在10脫乙酰漿果赤霉素Ⅲ10氧乙酰轉(zhuǎn)移酶（10DABT）的表達(dá)純化中，F(xiàn)ang等比較了GST系統(tǒng)、6His系統(tǒng)和PinPoint系統(tǒng)對(duì)融合蛋白表達(dá)和純化的影響，6His融合蛋白在高濃度誘導(dǎo)物條件下的表達(dá)水平最高，但只有25% 的可溶性蛋白，一步純化只得20%的純度，GST融合蛋白表達(dá)水平低一些，可溶性蛋白卻占了約80%，親和層析后純度為40%，可生物素化標(biāo)簽融合蛋白表達(dá)水平最低，可溶性蛋白只占40%，親和層析后純度60%，可見不同親和表達(dá)純化系統(tǒng)對(duì)上游、下游各個(gè)階段的影響不一樣，需要綜合平衡考慮（101）。由于S標(biāo)簽和S蛋白結(jié)合形成有活性的核糖核酸酶，可以靈敏的定量檢測(cè)融合蛋白。T7 標(biāo)簽為T7 基因10蛋白的最前面11個(gè)氨基酸，通過免疫親和層析進(jìn)行純化。這一系統(tǒng)可在多種表達(dá)系統(tǒng)中使用，主要的缺點(diǎn)是M1和M2親和介質(zhì)特別昂貴?？笷LAG的單M1和FLAG結(jié)合是Ca2+依賴的，加入螯和劑可以在溫和的條件下將融合蛋白洗脫，但M1 只能結(jié)合處在N端最外面的FLAG標(biāo)簽，所以只可用于去除信號(hào)肽后的FLAG融合蛋白。 FLAG肽序列（DYKDDDDK）的親水性很強(qiáng)，片段小，并且具有腸激酶的酶切位點(diǎn)，一般不會(huì)影響目標(biāo)蛋白的活性。9與傳統(tǒng)的親和融合系統(tǒng)相比，這一系統(tǒng)的最大優(yōu)點(diǎn)在于不需要使用蛋白酶來去除融合標(biāo)簽。 New England Biolabs 提供的IMPACT（InteinMediated Purification with an affinity Chitinbinding Tag）系統(tǒng)使用幾丁質(zhì)結(jié)合肽（來源于環(huán)狀芽胞桿菌）作為融合標(biāo)簽，表達(dá)的融合蛋白可以用幾丁質(zhì)親和層析純化，利用內(nèi)含肽（intein）的特異性原位剪切直接獲得目標(biāo)蛋白。 幾丁質(zhì)結(jié)合肽8 纖維素結(jié)合肽（CBD）融合蛋白能與纖維素介質(zhì)特異性的結(jié)合，可以在溫和的條件下洗脫（乙二醇或低鹽條件），pET CBD 載體含有纖維素結(jié)合肽（CBD）的序列，可方便構(gòu)建。 纖維素結(jié)合肽（CBD）7這一系統(tǒng)有如下優(yōu)點(diǎn)：1 特異性很高，因?yàn)榇竽c桿菌沒有可以和鈣調(diào)素結(jié)合的蛋白；2 與His標(biāo)簽相比可以在強(qiáng)還原性條件下純化。與硫氧還蛋白不同，MBP進(jìn)行C端融合也可以促進(jìn)蛋白的可溶性表達(dá)（107），擴(kuò)展了MBP的應(yīng)用。 大腸桿菌麥芽糖結(jié)合蛋白是malE基因的產(chǎn)物，定位在細(xì)胞的周質(zhì)空間，可以特異性的結(jié)合麥芽糖或糊精麥芽糖復(fù)合物，協(xié)助這些物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞內(nèi)。 麥芽糖結(jié)合蛋白（MBP）5 AviTag由篩選肽庫得到15 個(gè)氨基酸的短肽，具有一個(gè)單生物素化賴氨酸位點(diǎn)，與已知天然可生物素化一致序列完全不同，可以加在目標(biāo)蛋白的N端和C端，融合表達(dá)后，可被生物素連接酶BirA（細(xì)菌具有內(nèi)源性的生物素連接酶，但為了使重組蛋白完全生物素化，感受態(tài)細(xì)菌已轉(zhuǎn)化高水平表達(dá)生物素連接酶的質(zhì)粒）生物素化，為了純化重組蛋白選用低親和性的單體抗生物素蛋白或抗生物素蛋白衍生物，除了用于蛋白質(zhì)分離純化，還用于蛋白質(zhì)相互作用研究。這一系統(tǒng)不能進(jìn)行N端融合，而且變性劑會(huì)影響親和相互作用。 很少有蛋白在體內(nèi)可以被生物素化修飾，乙酰輔酶A的生物素羧基載體蛋白（BCCP）是存在于大腸桿菌（E. coli）的唯一一個(gè)可生物素化蛋白，生物素在生物素連接酶（BirA）的催化下特異性的修飾其中的一個(gè)賴氨酸殘基，研究表明其C末段101個(gè)氨基酸的肽段已經(jīng)具有可被生物素化的功能，Promega的PinPoint載體就編碼這個(gè)標(biāo)簽，使用其SoftLink親和素（即抗生物素蛋白）介質(zhì)可以在弱的條件下洗脫融合蛋白（5mM生物素溶液）。 生物素抗生物素蛋白（AvidinBiotin）是目前所知的最強(qiáng)的親和作用之一，其解離常數(shù)Kd為1015M，然而太強(qiáng)的結(jié)合使得重組蛋白很難在相對(duì)溫和的條件下洗脫下來，所以需要在親和標(biāo)簽/配體對(duì)的特異性和解離常數(shù)之間尋找一個(gè)平衡。4BB融合標(biāo)簽還可以刺激目的蛋白的抗體響應(yīng)，可用于免疫動(dòng)物生產(chǎn)。這一區(qū)域的不同部分BB、ABP和ABD被用于一步人白蛋白親和層析純化（結(jié)合有種屬特異性，對(duì)人的白蛋白結(jié)合最強(qiáng)），并在多種表達(dá)系統(tǒng)中得到應(yīng)用。鏈球菌Protein G是存在于某些鏈球菌菌株表面的雙功能受體，可以同時(shí)結(jié)合IgG和白蛋白，并且這兩段功能區(qū)域在結(jié)構(gòu)上分離。lich等對(duì)Protein A進(jìn)行了結(jié)構(gòu)改造，降低結(jié)合的強(qiáng)度，（102）。由于基于Protein A的親和標(biāo)簽的親和性比較高，要在相對(duì)劇烈的條件下（低pH）進(jìn)行洗脫，所以可能造成目標(biāo)蛋白的失活，另一個(gè)問題就是IgG親和層析介質(zhì)較貴，并且不耐清洗處理。為了使融合蛋白耐溴化氰和羥胺處理，對(duì)5個(gè)IgG結(jié)合結(jié)構(gòu)域中的B結(jié)構(gòu)域進(jìn)行了結(jié)構(gòu)改造，替換了溴化氰和羥胺處理敏感的氨基酸，就有了Z標(biāo)簽，越來越多的應(yīng)用更優(yōu)先選用Z標(biāo)簽和它的雙體ZZ標(biāo)簽。Protein A前體蛋白由信號(hào)肽序列、5個(gè)同源的IgG結(jié)合結(jié)構(gòu)域和細(xì)胞表面錨定序列組成，同源的5個(gè)IgG結(jié)合結(jié)構(gòu)域能夠分別結(jié)合IgG，Protein A已廣泛的用于的純化。 基于Protein A和Protein G的親和標(biāo)簽GST融合蛋白也常用來免疫動(dòng)物生產(chǎn)，以及作為載體蛋白進(jìn)行一些蛋白的結(jié)晶。用于親和純化的GST來源于日本血吸蟲，由于其分子量較大，而且以二聚體的形式存在溶液中，一般都需要去除融合標(biāo)簽。 谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶蛋白標(biāo)簽 圖6 用于金屬螯和層析的螯和配體。根據(jù)產(chǎn)品的介紹，TALON對(duì)蛋白質(zhì)組氨酸的排列有要求，為相鄰的組氨酸或處于特殊位置的兩個(gè)組氨酸，而這一點(diǎn)對(duì)NiNTA則不那么嚴(yán)格，所以TALON對(duì)His標(biāo)簽融合蛋白的選擇性也就更高，非特異性蛋白結(jié)合就更少。His標(biāo)簽也有一些缺點(diǎn)，如融合蛋白易形成包涵體，包涵體蛋白難于溶解，融合蛋白溶解后不能正確復(fù)性，層析時(shí)螯和的金屬離子容易泄漏（會(huì)使蛋白的氨基酸側(cè)鏈氧化，純化的得率降低，制品中殘留金屬離子對(duì)細(xì)胞、組織有毒性），金屬鰲和親和層析的非特異性結(jié)合會(huì)造成制品的純度不高，針對(duì)這些問題，現(xiàn)在發(fā)展的 His親和表達(dá)純化系統(tǒng)克服了其中的某些缺點(diǎn)，如使用結(jié)合金屬離子強(qiáng)的親和介質(zhì)NiNTA和TALON，使用HAT標(biāo)簽（HAT標(biāo)簽為雞乳酸脫氫酶的一段序列），六個(gè)組氨酸被其它氨基酸隔開，沒有正電荷聚集的現(xiàn)象，可改善溶解性和得率。它的主要優(yōu)點(diǎn)如下：1 標(biāo)簽的分子量小，一般不影響目標(biāo)蛋白的功能；2 (Xaa)2n^Lys/Arg/Gln，為外切酶，當(dāng)終止氨基酸為Gln時(shí)，可在谷氨酰胺環(huán)轉(zhuǎn)移酶和焦谷氨酰胺肽酶的作用下去掉Gln，可產(chǎn)生天然的目標(biāo)蛋白質(zhì)，特異性強(qiáng) 常用的一些親和標(biāo)簽rTEV蛋白酶，GluAsnLeuTyrPheGln^Gly，重組的煙草蝕紋病毒蛋白酶，具有8個(gè)氨基酸識(shí)別位點(diǎn)，高特異性，為內(nèi)切酶，在寬的溫度范圍里具有活性，與Histag融合后，酶切后使用金屬螯合親和層析清除凝血酶，LeuValProArg^GlySer，牛來源的含有其它蛋白質(zhì)，為內(nèi)切酶，存在非特異性的剪切，生物素化后可用鏈霉抗生物素蛋白親和層析清除腸激酶，AspAspAspAspLys^，重組的蛋白酶，為內(nèi)切酶，如果在賴氨酸后為脯氨酸則不能剪切，在其它的堿性氨基酸殘基后有非特異性剪切，溫度范圍為4℃到45℃羥胺，Asn^Gly，在pH為9條件下，需要加熱，45℃融合蛋白的剪切方法正是由于酶切以及成本方面的考慮，親和融合策略在工業(yè)上應(yīng)用并不廣泛。盡管如此，在進(jìn)行融合蛋白的酶切時(shí)會(huì)遇到一些特殊的問題，如酶切的效率受到酶切位點(diǎn)空間可及性和周圍氨基酸性質(zhì)的影響，常存在酶切不完全的現(xiàn)象；某些蛋白在酶切后會(huì)出現(xiàn)沉淀；使用內(nèi)肽酶可引起非特異性剪切的情況，如凝血酶屬于絲氨酸蛋白酶，在精氨酸和賴氨酸殘基后剪切，最優(yōu)的酶切位點(diǎn)為P4P3ProArg↓P1’P2’（P4和P3為疏水性氨基酸，P1’和P2’ 為非酸性氨基酸），非特性酶切的情況在表5的注釋里作了說明，而應(yīng)用廣泛的腸激酶也存在非特異性酶切的現(xiàn)象（92,97）?；瘜W(xué)方法廉價(jià)，但是常缺乏選擇性，而且使用劇烈的反應(yīng)條件常使目標(biāo)蛋白變性失活，使用蛋白酶的優(yōu)點(diǎn)是反應(yīng)的條件溫和（中性pH，溫度為4℃到37℃），特異性強(qiáng)。在進(jìn)行融合表達(dá)時(shí)，以下三種情況是不必去除親和標(biāo)簽：1. 目標(biāo)蛋白作為免疫原用來產(chǎn)生和純化；2. 目標(biāo)蛋白的生物活性不受融合標(biāo)簽的影響；3. 目標(biāo)蛋白用來直接固定化在介質(zhì)上。 親和標(biāo)簽的去除 是否在親和純化后去除標(biāo)簽9. 親和洗脫的條件7.首先要看針對(duì)目標(biāo)蛋白是否有方便有效的分析鑒定方法，如果沒有可選擇能夠進(jìn)行重組蛋白檢測(cè)的親和標(biāo)簽。 6.親和標(biāo)簽對(duì)表達(dá)水平的影響不僅與親和標(biāo)簽和目標(biāo)蛋白相關(guān)，還與可用的表達(dá)純化系統(tǒng)密切相關(guān)，需根據(jù)具體情況進(jìn)行分析。如果融合蛋白以包涵體的形式存在，由于大多數(shù)的親和標(biāo)簽不適于在變性劑存在條件下進(jìn)行親和純化，只能先進(jìn)行包涵體的溶解和復(fù)性，再在非變性條件下進(jìn)行親和純化，其中有些親和標(biāo)簽可以促進(jìn)蛋白的折疊復(fù)性，如來源于蛋白A的ZZ標(biāo)簽，可使胰島素樣生長(zhǎng)因子Ⅰ（IGFⅠ）融合蛋白在比非融合蛋白高100倍的濃度下成功折疊復(fù)性，并且不會(huì)形成沉淀（98），在選擇親和表達(dá)純化系統(tǒng)時(shí)需要考慮。在選擇融合位置時(shí)，另一個(gè)方面的考慮是，C端融合在去除融合標(biāo)簽后在目標(biāo)蛋白的C端會(huì)有幾個(gè)氨基酸殘留，而小心的選擇剪切特異性的氨基酸序列就可以在去除N端親和標(biāo)簽后得到天然的目標(biāo)蛋白。N端標(biāo)簽對(duì)表達(dá)蛋白的溶解性影響更大，如在N端使用天然HAT標(biāo)簽比6His標(biāo)簽有助于目標(biāo)蛋白的可溶性表達(dá)，而N端進(jìn)行MBP融合表達(dá)也常用來提高目標(biāo)蛋白的溶解性。多數(shù)情況下蛋白質(zhì)的N端區(qū)域?qū)Φ鞍踪|(zhì)的功能不是太重要，所以在N端進(jìn)行融合標(biāo)簽的融合常常能保留蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能。 親和標(biāo)簽所融合的位置3.如麥芽糖結(jié)合蛋白（MBP）具有分子伴侶樣的特性，進(jìn)行N端融合，常有助于蛋白質(zhì)的正確折疊和活性蛋白的獲得，目的蛋白的MBP融合已成功用于晶體結(jié)構(gòu)的研究（95）。降解的原因有兩種情況，一是目標(biāo)蛋白的不正確折疊，那么加入親和標(biāo)簽如果能夠促進(jìn)目標(biāo)蛋白的正確折疊將有助于防止蛋白質(zhì)的降解，第二種情況是末端氨基酸不穩(wěn)定，這時(shí)的原則是，N端融合有助于保護(hù)目標(biāo)蛋白的N端，而C 端融合有助于保護(hù)目標(biāo)蛋白的C 端，從而可以獲得全長(zhǎng)的目標(biāo)蛋白。 蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性2.從另一方面來講目標(biāo)蛋白可能會(huì)干擾短肽標(biāo)簽與其配體的結(jié)合，與小的短肽標(biāo)簽相比，大的多肽和蛋白質(zhì)標(biāo)簽也在實(shí)驗(yàn)室作為常規(guī)選擇，它們的親和配體大多是低分子化合物，可以降低目標(biāo)蛋白對(duì)結(jié)合的影響，增強(qiáng)純化的特異性（111），許多情況下，重組融合蛋白去除親和標(biāo)簽后，目標(biāo)蛋白可形成正確的結(jié)構(gòu)。親和標(biāo)簽與目標(biāo)蛋白之間的作用是相互的，需要綜合的考慮，既要考慮到對(duì)目標(biāo)蛋白結(jié)構(gòu)功能的影響，又要考慮到對(duì)標(biāo)簽與其配體親和作用的影響，以及實(shí)際的用途。 選擇親和標(biāo)簽時(shí)需要考慮的因素 有的親和標(biāo)簽可以提高目標(biāo)蛋白可溶性表達(dá)的水平。1.基于重組蛋白質(zhì)與配體的結(jié)合特性，一些重組蛋白質(zhì)應(yīng)用親和層析進(jìn)行純化，如將、受體或體外噬菌體展示技術(shù)篩選的親和體（affibody）偶聯(lián)在親和介質(zhì)上進(jìn)行親和純化，但這類應(yīng)用僅限于特定的蛋白質(zhì)，而利用DNA重組技術(shù)使目標(biāo)蛋白與親和標(biāo)簽融合表達(dá)，控制重組分子的親和選擇性，進(jìn)行融合蛋白的親和純化，已成為純化重組蛋白的常用遺傳策略。在重組蛋白的分離純化中，與其它層析方法相比，親和層析的純化能力更為強(qiáng)大，一步純化就可以得到很高的純度，可以使蛋白質(zhì)純化1001000倍，活性蛋白的回收率通常很高，而且可以純化其它方法難以分離的蛋白質(zhì)。親和層析基于蛋白質(zhì)和親和配體的特異性相互作用，是最為高效的分離純化方法，用于親和層析的配體可以是針對(duì)抗原的、針對(duì)蛋白質(zhì)分子的受體、酶的底物或抑制劑、針對(duì)糖分子的凝集素、活性染料、金屬離子、天然或改造過的相互作用多肽等等。傳統(tǒng)的片狀羥基磷灰石物理和化學(xué)穩(wěn)定性比較差，僅能在低流速條件下使用，新的