基因工程的下游技術(shù)重組蛋白的表達(dá)、純化和分析-文庫吧資料
2024-09-24 20:44本頁面
【正文】 回收，經(jīng)再生可循環(huán)使用。否則，凝膠柱會(huì)產(chǎn)生氣泡，就會(huì)影響層析效果。 Sample16， 外加 Marker（ 見實(shí)驗(yàn)十一 ） 。 （測得的 OD280值曲線峰為目的蛋白峰 GFP， 標(biāo)Sample6 ） 。 6. 洗脫： 用含 300mmol/L咪唑的洗脫緩沖液 10mL洗脫， 用 Ep管分部收集洗脫液 。 再用 10mL起始緩沖液過層析柱 ， 操作同前 。L準(zhǔn)備用于電泳 ， 作為親和層析分離前上清液中的總蛋區(qū)帶對(duì)照?qǐng)D譜 （ Sample3） 。 ⑦ 用 5 倍柱體積的起始緩沖溶液平衡層析柱，備用。 ⑥ 用 10倍柱體積的無離子水洗滌層析柱除去多余的鎳離子。 ⑤ 用 2倍柱體積的 ，使凝膠金屬鎳離子結(jié)合 , 流速 2mL/min。 ③ 用 5倍柱體積的 1 mol/L NaOH溶液洗滌層析柱，流速 2mL/min。 1drops/2s! ② 用 5倍柱體積的 2 mol/L NaCl 溶液洗親和層析柱除去多余的 EDTA。 親和層析劑為 45mL。 加入少量的無離子水 ， 排去下端的空氣泡 。放冰箱備用。共處理六周期。 500mL ⑥ Chelating Sepharose Fast Flow 45 mL ⑦ 大腸桿菌細(xì)胞裂解蛋白樣品 1020mL ⑧ 洗滌液： 50mmol/L咪唑； 50mmol/L TrisHCl； ， pH ⑨ 洗脫液： 300mmol/L咪唑； 50mmol/L TrisHCl； ， 四． 實(shí)驗(yàn)儀器 X 50cm層析柱、自動(dòng)分部收集器、紫外分光光度計(jì)、紫外檢測儀及記錄儀等。 2. 試劑 ① ② 2mol/L NaCl 溶液 50mL ③ 1mol/L NaOH溶液 50mL ④ ⑤ 起始緩沖液： 50mmol/L TrisHCl。 ? 用 IPTG誘導(dǎo)表達(dá)的蛋白質(zhì)含有特定的組氨酸標(biāo)簽 ， 這種可溶性蛋白質(zhì)能用金屬親和層析法進(jìn)行分離 ， 且操作簡單 ， 快速 ， 純化效率高 。 在堿性 pH時(shí)吸附更有效 ，但選擇性降低 。已知蛋白質(zhì)中的組氨酸和半胱氨酸殘基在接近中性的水溶液中能與鎳或銅離子形成比較穩(wěn)定的絡(luò)合物，因此，連接上鎳或銅離子的載體凝膠可以選擇性地吸附含咪唑基和巰基的肽和蛋白質(zhì)。 二． 實(shí)驗(yàn)原理 ? 以普通凝膠作載體，連接上金屬離子制成螯合吸附劑，用于分離純化蛋白質(zhì)，這種方法稱為金屬螯合親和層析。 2. 為什么誘導(dǎo)表達(dá)的大腸桿菌要在其OD600濃度約為 IPTG？ 3. 大腸桿菌的誘導(dǎo)表達(dá)常受哪些因素的影響？ 實(shí)驗(yàn)十二 金屬鰲合親和層析分離目的蛋白質(zhì) 一． 實(shí)驗(yàn)?zāi)康? 二． 實(shí)驗(yàn)原理 三． 材料與試劑 四． 實(shí)驗(yàn)儀器 五． 操作步驟 六． 注意事項(xiàng) 七． 實(shí)驗(yàn)安排 八． 思考與討論 一 ． 實(shí)驗(yàn)?zāi)康? ? 學(xué)習(xí)親和層析的原理 。（步驟 3） 第二天： 收菌、紫外觀察結(jié)果和拍照； 破碎細(xì)菌，分離上清，待過柱。 離心后收集的菌體在紫外線的照射下可見黃綠色熒光 ， 所以把 4沉淀菌體放在紫外燈下觀察其是否有熒光以及熒光的強(qiáng)弱 ， 就可判斷其是否有表達(dá)及其所表達(dá)的強(qiáng)度 。 在科研中一般都采用不同溫度或不同濃度的 IPTG來誘導(dǎo) ， 以獲得最大的蛋白表達(dá)量 。 6瓶僅加 IPTG 。 2管不加 IPTG和葡萄糖。 按 1:100接種 對(duì)照 IPTG+Glc IPTG 1＃ 2＃ 3＃ 6＃ 1＃ 2＃ 3＃ 4＃ 5＃ 25 ℃ 28℃培養(yǎng)過夜 5000rpm離心 ， 收菌體 取 5mL離心 其余離心收菌體，提取蛋白 六． 注意事項(xiàng) 1. 本實(shí)驗(yàn)的目的是比較該重組 DNA在大腸桿菌中表達(dá)時(shí)受 IPTG和葡萄糖存在的影響。 1＃ 2＃ 3＃ 6＃ pUC18 pGFPuv 挑取單菌落，接種于5mLLBA培養(yǎng)基中。 注意：把 1和 2管置 4℃ 保存。分別將 13全部培養(yǎng)物收集到三個(gè) 7mL離心管中，編上相應(yīng)編號(hào)，離心棄上清；三角瓶培養(yǎng)的 50mL菌液混勻后取 5mL于7mL離心管中（編號(hào)為 4），離心，上清收集到另一個(gè)指管，編號(hào)為 5，其余的培養(yǎng)液用 50mL離心管于 5000rpm， 4℃ ，離心 10min，棄上清，菌體用裂解緩沖液重懸后用超聲波破碎細(xì)胞或保存于－ 20℃ 備用（見實(shí)驗(yàn)十二）。 3. 1：接 50μL空載工程菌（含 pUC18） 過夜培養(yǎng)物， 2528℃ 培養(yǎng) 10 h12h； 2：接 50μL重組菌 （ 含 pGFPuv） 過夜培養(yǎng)物 ， 2528℃ 培養(yǎng) 10 h12h； 3：接 50μL重組菌 （ 含 pGFPuv ） 過夜培養(yǎng)物 ， 37℃ 培養(yǎng)至 （ 約 3h4h)，然后加入 20%葡萄糖 50μL至終濃度為 %，及 100mM IPTG 5μL至終濃度為 ， 2528℃ 培養(yǎng) 8h10h或過夜； 6：接 500μL重組菌 （ 含 pGFPuv） 過夜培養(yǎng)物 ， 37℃ 培養(yǎng)至 （ 約 3h4h)，然后只加入 100mM IPTG 50μL至
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